發(fā)布時(shí)間：2019-08-07所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：利用室內(nèi)流水式粘油礫石柱模擬實(shí)際環(huán)境中的海底重燃油,研究了重燃油污染的孔隙水對(duì)成年海膽繁殖力、配子質(zhì)量及子代胚胎發(fā)育的影響. 結(jié)果表明,暴露結(jié)束后(7d),暴露組海膽的排配子率顯著降低(P=0.033),同時(shí)雌海膽繁殖力也顯著降低(P=0.036,(195791781147
摘要：利用室內(nèi)流水式粘油礫石柱模擬實(shí)際環(huán)境中的海底重燃油,研究了重燃油污染的孔隙水對(duì)成年海膽繁殖力、配子質(zhì)量及子代胚胎發(fā)育的影響. 結(jié)果表明,暴露結(jié)束后(7d),暴露組海膽的排配子率顯著降低(P=0.033),同時(shí)雌海膽繁殖力也顯著降低(P=0.036,(1957917±811471)個(gè)卵細(xì)胞);卵細(xì)胞的直徑和精子的受精能力并未受到海底重燃油的影響.子代繼續(xù)暴露 48h,發(fā)現(xiàn)親代暴露加劇了子代胚胎畸形程度,表明親代暴露的毒性可傳遞給子代.進(jìn)一步利用整合毒性指數(shù)(ITI)檢測(cè)毒性傳遞的性別差異發(fā)現(xiàn),與母本效應(yīng)相比(24 和 48h 子代的 ITI 分別為 0.54~1.45 和 1.1~2.57),父本效應(yīng)(24 和 48h 子代的 ITI 分別為 0.82~1.95 和 1.89~4.04)在毒性傳遞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用.
關(guān)鍵詞：海底重燃油;孔隙水;親本效應(yīng);海膽;早期發(fā)育
1970~2016 年間,世界范圍內(nèi),發(fā)生了超過(guò) 1000 起船舶溢油事故,其中絕大多數(shù)事故(81%)為小型船舶溢油事故(即溢油量<7t)[1].中小型船舶溢油事故泄漏的油品往往是重燃油(HFO),其導(dǎo)致的 HFO 溢出量占 HFO 總溢出量的 80%以上[2].HFO 是一種原油精煉產(chǎn)品.HFO 黏度大(15℃運(yùn)動(dòng)黏度 5000~ 30000mPa·s),分散和自然降解十分困難.在風(fēng)浪作用下,HFO 可以出現(xiàn)在距溢油事故發(fā)生地點(diǎn)相當(dāng)遠(yuǎn)的地方,使海岸線和敏感海域受到污染[3].此外,HFO 密度較高(0.92~1.02g/cm3 ),在碎波帶與泥沙混合后,更易于沉降.沉降后,在波浪和潮汐的作用下 HFO 可以在水體和砂礫海灘之間循環(huán),源源不斷地釋放多環(huán)芳烴(PAHs)對(duì)水生生物產(chǎn)生毒害作用,這個(gè)過(guò)程就是孔隙水毒性假說(shuō)[4].
已有學(xué)者在實(shí)驗(yàn)室條件下利用裝填粘油礫石的容器模擬近岸處海底 HFO,發(fā)現(xiàn)魚類胚胎的畸形率和死亡率與流經(jīng)粘油礫石的水體中 PAHs 濃度相關(guān)[5-9]. 事實(shí)上,海洋底棲生物,由于棲息在海底,不僅會(huì)暴露在有毒孔隙水中,還可能與海底 HFO 直接接觸,加之其活動(dòng)能力低下難以逃出污染區(qū),勢(shì)必會(huì)受到海底 HFO 的脅迫,因此海底 HFO 對(duì)海洋底棲生物的毒性影響亟待研究.
海膽主要棲息于淺海的巖礁、礫石、砂石等海底,對(duì)淺海生物群落的組成、結(jié)構(gòu)和多樣性起著關(guān)鍵的作用[10-13].海膽生活史包括浮游幼體和底棲成體兩個(gè)主要階段.不僅早期浮游幼體對(duì)污染敏感性高 [14-21],其成年階段也被視作海洋生態(tài)毒理學(xué)研究和環(huán)境監(jiān)測(cè)的有效生物模型[22-26].成年動(dòng)物的繁殖能力對(duì)整個(gè)物種的延續(xù)起著至關(guān)重要的作用,海底 HFO 對(duì)成年海膽的毒害作用勢(shì)必會(huì)影響到其體內(nèi)配子的生成、排放、受精過(guò)程,進(jìn)一步影響子代發(fā)育, 從而對(duì)整個(gè)種群的生存產(chǎn)生影響[27-34].
本文以裝填粘油礫石的容器模擬海底 HFO,選擇海洋底棲模式生物海膽為受試生物,研究海底 HFO 對(duì)親代成年海膽繁殖能力、配子質(zhì)量及其子代胚胎早期發(fā)育的影響.以期為評(píng)估溢油對(duì)海膽種群數(shù)量的影響提供參考數(shù)據(jù),同時(shí)為海洋生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、自然資源損害評(píng)估以及船舶溢油索賠提供重要科學(xué)依據(jù).
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)油品 HFO380,運(yùn)動(dòng)黏度 729800mPa·s (50℃),密度 0.9821g/cm3,由大連海洋燃油有限公司提供. 1.1.2 實(shí)驗(yàn)礫石 直徑為 10~50mm 的表面平整的礫石,取自大連銀沙灘,洗凈烘干后備用.
1.1.3 實(shí)驗(yàn)海水 取自大連市星海灣,鹽度(34±1) PSU,pH=(8.0±0.03).
1.1.4 實(shí)驗(yàn)海膽馴化 繁殖期成年海膽購(gòu)自大連海寶漁業(yè)有限公司.每只海膽注射 0.5mL 的 KCl,排黃色配子的為雌海膽,排白色配子的為雄海膽.將成功排配子的海膽在實(shí)驗(yàn)室海水循環(huán)系統(tǒng)(大連匯鋅鈦設(shè)備)中馴化 2 周,海水溫度為(18±1)°C,光照周期為 12h:12h.期間每 3d 投喂海膽體重 5%的新鮮海帶.暴露實(shí)驗(yàn)開始前 3d 停止喂食.馴化期間未出現(xiàn)自發(fā)排配子和死亡個(gè)體.
1.2 方法
1.2.1 粘油礫石制備[5,7,9] 將一定量的 HFO380 與 1.8kg 潔凈礫石放入混合容器中劇烈晃動(dòng) 2min,使油盡可能的均勻的覆蓋在礫石表面.為避免相互干擾, 按粘油量由低至高依次制備不同濃度的粘油礫石. 然后將粘油礫石置于避光通風(fēng)處 24h,用于暴露實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)設(shè)置粘油礫石濃度為 0,400,800,1600,3200 和 6400μg 油/g 礫石(下文簡(jiǎn)寫為 μg/g).0μg/g 為對(duì)照組.Zhadan 和 Vaschenko 的研究[33]表明暴露于被柴油污染的海水中 ( 總石油烴 (TPH) 濃 度 約 為 300μg/L)50d 的雌海膽所產(chǎn)子代的畸形率增加;在此基礎(chǔ)上,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)本文選擇 400μg/g 濃度組為最低濃度組,該組暴露液中 TPH 濃度從 618.5μg/L 降至 308.6μg/L.進(jìn)一步預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),暴露于 16000μg/g 濃度組的雌海膽 2d 后出現(xiàn)自發(fā)排卵現(xiàn)象.暴露于 8000 和 4000μg/g 濃度組的雌海膽,在 7d 暴露期內(nèi)未出現(xiàn)自發(fā)排卵現(xiàn)象,但是 8000μg/g 濃度組的雌海膽排卵數(shù) 目 少 . 不 足 以用于后 續(xù)子代 的暴露實(shí)驗(yàn) , 而 4000μg/g 組的雌海膽產(chǎn)卵數(shù)量足以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn). 因 此 本文最 高濃度組的粘油量 應(yīng) 介 于 4000~ 8000μg/g 之間.因此本文選擇 400,800,1600,3200 和 6400 μg/g,以此保證可以觀察到親代效應(yīng),并保證有足夠的卵細(xì)胞用于后續(xù)暴露實(shí)驗(yàn).
1.2.2 動(dòng)態(tài)暴露裝置 裝置為上下加蓋的聚氯乙烯(PVC)柱(d=10.8cm,H=35cm),距底部 3cm 處有一進(jìn)水管(d=1.2cm),出水管(d=1.2cm)位于對(duì)面距頂部 3cm 處,底部配備一個(gè)由 PVC 支柱(H=3.5cm)支撐的 PVC 網(wǎng)孔圓板放置礫石(圖1).進(jìn)水流速以針閥控制. 粘油礫石制備完成后,轉(zhuǎn)移至該裝置,海水流速 20mL/min 由下至上流經(jīng)粘油礫石柱,24h 后盛接流出液進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn).
1.2.3 親代海膽暴露方法每個(gè)濃度組設(shè)置 3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)包括 6 只雌海膽和 6 只雄海膽,雌雄海膽分開暴露(圖 1).暴露容器上部開孔,保證暴露溶液體積為 6L.暴露時(shí)間為 7d,暴露期間不充氣不喂食, 并虹吸出容器底部排泄物.
1.2.4 子代胚胎獲取及暴露方法 親代海膽暴露結(jié)束后,用 0.45μm 濾膜過(guò)濾海水(FSW)清洗體表,然后經(jīng)圍口膜向海膽體腔內(nèi)注射 1mL 現(xiàn)配的 KCl 溶液(0.5M).雌海膽口面向上置于盛滿 FSW 錐形瓶口處,雄海膽口面向上,擦干體表后置于干燥的培養(yǎng)皿上.30min后將雌海膽取下,將每重復(fù)組6只雌海膽所產(chǎn)卵細(xì)胞混合,置于18℃的FSW中暫放待受精.每重復(fù)組的 6 只雄海膽所排精子混合后置于 4℃待受精. 取 10μL 干精子稀釋于 5mL 的 FSW 中,加入到 500mL密度為100個(gè)/mL的卵細(xì)胞溶液中,輕輕晃動(dòng)進(jìn)行受精[35].胚胎親本組合有4種(如圖2所示):對(duì)照組(對(duì)照組卵細(xì)胞和對(duì)照組精子受精),母本暴露組 (暴露組卵細(xì)胞和對(duì)照組精子受精),父本暴露組(對(duì)照組卵細(xì)胞和暴露組精子受精)和雙本暴露組(暴露組卵細(xì)胞和同組精子受精).受精 15min 后,虹吸法洗卵 3 次以去除多余的精子.
來(lái)自于暴露親本的胚胎暴露濃度與其親代暴露濃度相同.對(duì)照組胚胎均分為 6 份,分別于 FSW 和粘油礫石柱流出液中培養(yǎng).因此對(duì)于子代暴露實(shí)驗(yàn), 共有 5 個(gè)暴露濃度,每個(gè)濃度組包括 4 種親本組合的胚胎.胚胎于黑暗處(18±1)℃的水浴中培養(yǎng),期間無(wú)需換水和喂食.
1.2.5 親代海膽相關(guān)參數(shù)測(cè)定 排配子率指排配子的雌或雄海膽個(gè)數(shù)與對(duì)應(yīng)性別的海膽總數(shù)的比值.繁殖力指雌海膽開始排卵的 30min 內(nèi)排出的卵的個(gè)數(shù)[36],其中將未排卵的雌海膽繁殖力記為 0.卵細(xì)胞計(jì)數(shù)使用 0.1mL 的浮游生物計(jì)數(shù)框進(jìn)行,每只海膽重復(fù)計(jì)數(shù) 4 次并取平均值作為一只海膽的繁殖力.
1.2.6 配子質(zhì)量 將每重復(fù)組 6 只雌海膽的卵細(xì)胞混合,取 3 個(gè) 1mL 重復(fù)樣品,滴入幾滴 40%福爾馬林,置于 4℃待測(cè).顯微鏡(OLYMPUS IX73)觀測(cè)并拍照,使用 Cell Standard 軟件測(cè)量卵細(xì)胞直徑,每個(gè)樣品至少測(cè)量 100 個(gè)卵細(xì)胞.于受精 15min 后取 3 個(gè) 1mL重復(fù)樣品,加入幾滴40%福爾馬林置于4℃待觀察受精率.以受精膜鼓起為受精成功標(biāo)志,每個(gè)樣品至少觀察 100 個(gè)受精卵.
1.2.7 子代海膽胚胎早期發(fā)育觀察 分別于受精后 24h(原腸胚期)和 48h(長(zhǎng)腕幼蟲期)取樣,每重復(fù)組各取 4 個(gè) 2mL 重復(fù)樣品并滴入 40%福爾馬林放于 4 ℃, 在24h 內(nèi)完成觀察,并記錄畸形率.正常發(fā)育的胚胎形態(tài)應(yīng)滿足 4 個(gè)條件[37-38]:(1)胚胎在受精后 24h 進(jìn)入原腸胚時(shí)期,受精后 48h 進(jìn)入長(zhǎng)腕幼蟲期;(2)胚胎呈現(xiàn)左、右和背、腹側(cè)對(duì)稱;(3)原腸期具備發(fā)育良好的原腸,長(zhǎng)腕幼蟲期具備結(jié)構(gòu)完整的消化道(口、胃、腸);(4) 長(zhǎng)腕幼蟲期具備發(fā)育良好的骨針和腕.
1.2.8 綜合毒性指數(shù)(ITI)[35] 根據(jù)發(fā)育是否延遲和形態(tài)是否畸形,每個(gè)胚胎賦予從 0~10 不同分值.24h 正常晚期原腸胚為 0 分,原腸胚、囊胚和桑椹胚各得 1,3 和 4 分;當(dāng)胚胎出現(xiàn)畸形形態(tài)時(shí),原腸胚、囊胚和桑椹胚各得 5,7 和 10 分.48h 正常長(zhǎng)腕幼蟲為 0 分,早期長(zhǎng)腕幼蟲、棱柱幼蟲、原腸胚、囊胚和桑椹胚各得 2,3,4,5 和 5.5 分;當(dāng)胚胎出現(xiàn)畸形形態(tài)時(shí), 長(zhǎng)腕幼蟲、早期長(zhǎng)腕幼蟲、棱柱幼蟲、原腸胚、囊胚和桑椹胚各得 6,7,7.5,8,9 和 10 分.ITI 根據(jù)以下公式計(jì)算:
10 ITI ( )/100 n i i i S F = = ? ∑ (1)
式中:Si 為每類畸形胚胎得分;Fi 為這類胚胎出現(xiàn)的頻率(i=10).
1.2.9 暴露溶液組分分析方法 暴露期間每隔 24h 取水樣分析暴露液 TPH 濃度和 PAHs 濃度. TPH 采用紫外法測(cè)定(BIOTEK EPOCH2)[39].各濃度組各取 3 個(gè)混合流出液重復(fù)樣品,正己烷萃取,并于 225nm 下正己烷調(diào)零測(cè)定吸光度.根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算 TPH 濃度:
y = 0.051x-0.0033 (2)
式中:y 為樣品萃取液吸光度與正己烷吸光度差值;x 為萃取液 TPH 濃度,mg/L;R2 =0.9996.
PAHs 濃度采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS) 測(cè)定.樣品前處理步驟參照 GB/T 21247-2007《海面溢油鑒別系統(tǒng)規(guī)范》[40].儀器型號(hào) GC(HP 6890GC)- MS(5975),選擇SIM模式,內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析.色譜柱 為 DB-5MSUI, 長(zhǎng) 30m, 內(nèi) 徑 0.32mm, 膜 厚 度 0.25μm.載氣為高純氮?dú)?流量 1mL/min.升溫程序:50℃保持 2min,以 8℃/min 的速度升溫至 150℃, 保持 3min;再以 3℃/min 速度升溫至 300℃,保持 15min.分析 16 種 PAHs:萘,苊烯,苊,芴,菲,蒽,熒蒽,芘, 苯并[a]蒽,苯并[b]熒蒽,苯并[k]熒蒽,苯并[a]芘,茚并 [1,2,3-cd]芘,二苯并[a,h]蒽,苯并[ghi]芘.
1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有生物測(cè)定結(jié)果均以 3 個(gè)重復(fù)組測(cè)定值的(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示.采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)(Shapiro–Wilk 法) 和方差同質(zhì)性檢驗(yàn)(Levene 法).若數(shù)據(jù)滿足以上條件則進(jìn)行方差分析,事后檢驗(yàn)方法采用 Tukey HSD, 若方差不齊則事后檢驗(yàn)采用 Dunnett 法.若數(shù)據(jù)不滿足以上 2 個(gè)條件,則采用非參數(shù)檢驗(yàn)的 Kruskal Wallis 法和 Mann Whitney 法進(jìn)行顯著性差異分析. 不同發(fā)育時(shí)期之間的差異采用配對(duì) T 檢驗(yàn)法. P<0.05 表示差異顯著.TPH 濃度為 3 個(gè)重復(fù)樣品的 (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差),使用 OriginPro 軟件對(duì) TPH 濃度和 PAHs 濃度進(jìn)行擬合.
2 結(jié)果與討論
2.1 暴露溶液組分分析
2.1.1 TPH 濃度隨時(shí)間和礫石粘油量的變化 粘油礫石柱是一種模擬近岸處沉降溢油的動(dòng)態(tài)系統(tǒng) [41].結(jié)果表明隨著海水流經(jīng)粘油礫石柱,所有濃度組的流出液中的 TPH 濃度呈指數(shù)形式降低,并具有良好相關(guān)性(R2 >0.95)(見表 1).這與溢油事故發(fā)生后實(shí)際測(cè)得的近岸處海水 TPH 濃度變化趨勢(shì)一致[42]. 此外,根據(jù)擬合公式可對(duì)毒性進(jìn)行定量表征,克服了動(dòng)態(tài)暴露系統(tǒng)中暴露溶液濃度難以預(yù)測(cè)的缺點(diǎn).
分析不同粘油量礫石柱在經(jīng)海水沖洗相同時(shí)間后流出液中 TPH 濃度變化,發(fā)現(xiàn) TPH 濃度與礫石粘油量呈正相關(guān)(R2 >0.84)(見表 2).
2.1.2 PAHs 隨時(shí)間的變化及其與 TPH 的關(guān)系 親代海膽暴露期間溶液中 PAHs 濃度逐漸減小,并且各種組分之間的相對(duì)含量也有所變化.例如,6400μg/g 組暴露溶液中的 PAHs 含量在親代暴露期間由最初的 13.140μg/L 降低到結(jié)束時(shí)的 3.530μg/L.開始暴露時(shí),暴露溶液中最主要的 PAHs 為萘(84.4%),其次為菲(7.3%).萘的分子量相對(duì)低且易揮發(fā),暴露結(jié)束時(shí)萘的含量?jī)H占了 38.2%,菲的相對(duì)含量增加到了 27.5%[7].6400μg/g 組粘油礫石上的 PAHs 濃度由 9.806μg/g 降低到了 6.408μg/g,各組分的相對(duì)含量也發(fā)生改變,萘相對(duì)含量由28.4%降低到15.8%,而菲的相對(duì)含量由 23.1%升高到 28.2%.
通過(guò)分析 6400μg/g 組暴露溶液中 PAHs 濃度及其對(duì)應(yīng)的 TPH 濃度在 7d 內(nèi)的變化趨勢(shì),發(fā)現(xiàn)盡管 PAHs 的各種組分相對(duì)含量有所不同,但是 PAHs 濃度和 TPH 濃度在暴露期間呈現(xiàn)良好相關(guān)性(R2 = 0.866).考慮到 TPH 濃度與礫石粘油量呈良好相關(guān)性,因此本文中毒性均以礫石粘油量進(jìn)行對(duì)比分析.
2.2 對(duì)親代海膽生長(zhǎng)繁殖的影響
暴露在粘油礫石柱流出液中 7d 后,海膽排配子率顯著降低(Kruskal-Wallis,P=0.033).粘油礫石對(duì)海膽排配子率的影響無(wú)性別差異性(Mann Whitney, P>0.05).另外,與對(duì)照組相比((5551667±714587)個(gè)卵細(xì)胞),6400μg/g 組雌海膽排卵數(shù)量減少((1957917± 811471)個(gè)卵細(xì)胞),繁殖力顯著降低(1-way ANOVA, P=0.036),表明粘油礫石流出液 7d 暴露影響了海膽的繁殖狀態(tài).這可能與壓力環(huán)境下海膽性腺內(nèi)性細(xì)胞再吸收作用相關(guān),性細(xì)胞的再吸收可以使海膽將更多的能量分配到細(xì)胞解毒和保護(hù)過(guò)程中.
2.3 對(duì)配子質(zhì)量的影響
暴露組卵細(xì)胞的大小與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(1-way ANOVA,P>0.05).結(jié)果表明,粘油礫石暴露對(duì)卵細(xì)胞的尺寸無(wú)顯著效應(yīng),說(shuō)明卵細(xì)胞的大小不適合作為監(jiān)測(cè)短期粘油礫石暴露對(duì)成年海膽繁殖狀態(tài)影響的指標(biāo).已有研究發(fā)現(xiàn)海膽種群密度大的區(qū)域雌海膽所排卵細(xì)胞較小,而種群密度小的區(qū)域雌海膽所排卵細(xì)胞較大,說(shuō)明卵細(xì)胞的大小具有可塑性[43].Sch?fer 等[44]的研究發(fā)現(xiàn)菲的濃度為500μg/L暴露20d,抑制海膽性腺內(nèi)未成熟卵細(xì)胞的生長(zhǎng).據(jù)此推斷本研究中卵細(xì)胞尺寸未發(fā)生變化可能是因?yàn)楸┞稌r(shí)間較短,雌海膽未能及時(shí)調(diào)整卵細(xì)胞大小.
親代海膽暴露在粘油礫石柱流出液中 7d 對(duì)受精率并無(wú)顯著影響(2-way ANOVA,P>0.05),最大受精率為 800μg/g 組的雙本暴露受精卵((99.23± 0.69)%).結(jié)果表明,雄海膽短期暴露于粘油礫石流出液中并未影響精子的受精能力,與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[28,46].
2.4 對(duì)子代海膽胚胎早期發(fā)育的影響
將各組子代繼續(xù)暴露在相同濃度的流出液中培養(yǎng) 48h,并在胚胎受精后 24h 原腸期(圖 3)和 48h 長(zhǎng)腕幼蟲期(圖 4)觀測(cè)子代畸形率,并計(jì)算綜合毒性指數(shù)(ITI,表 3).生長(zhǎng)在 FSW 中的對(duì)照組雙親子代畸形率始終低于 10%.
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