發(fā)布時(shí)間：2021-09-08所屬分類(lèi)：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的建立聚丙烯藥用滴眼劑瓶無(wú)菌檢查方法。方法洗脫液為0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，取樣量參照《中國(guó)藥典》四部通則1101醫(yī)療器械，瓶身中加入標(biāo)示容量的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，旋緊外蓋振搖30s，合并提取液后采用薄膜過(guò)濾法檢查;內(nèi)蓋采用直接接種法檢查。結(jié)果無(wú)
摘要:目的建立聚丙烯藥用滴眼劑瓶無(wú)菌檢查方法。方法洗脫液為0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，取樣量參照《中國(guó)藥典》四部通則<1101>醫(yī)療器械，瓶身中加入標(biāo)示容量的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，旋緊外蓋振搖30s，合并提取液后采用薄膜過(guò)濾法檢查;內(nèi)蓋采用直接接種法檢查。結(jié)果無(wú)菌檢查前處理研究中低濃度人工污染的枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白色念珠菌的回收率均符合《中國(guó)藥典》要求;方法適用性實(shí)驗(yàn)中試驗(yàn)菌生長(zhǎng)均良好。結(jié)論本法取樣量和樣品前處理方法科學(xué)有效，適用于聚丙烯藥用滴眼劑瓶的無(wú)菌檢查。
關(guān)鍵詞:聚丙烯滴眼劑瓶;直接接種法;薄膜過(guò)濾法;無(wú)菌檢查
聚丙烯滴眼劑瓶是目前國(guó)內(nèi)常用的滴眼劑包裝形式[1]，這種塑料包裝材料在高溫下易變形，因此采用本材料包裝的無(wú)菌滴眼劑需采用非終端滅菌的無(wú)菌生產(chǎn)工藝進(jìn)行無(wú)菌灌裝。聚丙烯滴眼劑瓶應(yīng)在無(wú)菌灌裝前進(jìn)行滅菌確保其無(wú)菌。藥品包裝材料的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)直接影響藥品質(zhì)量[2-7]，尤其是非終端滅菌無(wú)菌制劑的藥品包裝材料，為確保此類(lèi)藥品的質(zhì)量安全，必須嚴(yán)格控制包裝材料的微生物污染。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)中滴眼劑增加了無(wú)菌檢查，滴眼劑按無(wú)菌制劑進(jìn)行生產(chǎn)，但現(xiàn)行《國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》僅規(guī)定創(chuàng)傷或手術(shù)滴眼劑瓶進(jìn)行無(wú)菌檢查，與目前相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不符。且《國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》中無(wú)菌檢查僅簡(jiǎn)單規(guī)定檢查方法，參照《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法，導(dǎo)致聚丙烯滴眼劑瓶無(wú)菌檢查在實(shí)際操作中遇到如取樣量代表性等問(wèn)題，且未按《中國(guó)藥典》要求進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，因此樣品前處理方法和無(wú)菌檢查方法的選擇等方面皆有待改善。由于聚丙烯滴眼劑瓶包含瓶身、外蓋及內(nèi)蓋，包裝形式相互獨(dú)立，本實(shí)驗(yàn)分別以滴眼劑瓶瓶身、外蓋和內(nèi)蓋為對(duì)象進(jìn)行無(wú)菌檢查方法的研究，通過(guò)取樣量、樣品前處理方法和無(wú)菌檢查方法適用性等研究，對(duì)本品的無(wú)菌檢查方法進(jìn)行全面改善，提高聚丙烯滴眼劑瓶無(wú)菌檢查的操作性、適用性及使用安全性。
1材料與方法
1.1材料聚丙烯藥用滴眼劑瓶(規(guī)格:5ml，批號(hào):171206;規(guī)格:8ml，批號(hào):171220;規(guī)格:10ml，批號(hào):161129)均由慈溪市觀城塑料包裝容器廠(chǎng)提供。
1.2儀器與試劑HTY-2000B型集菌儀(中國(guó)杭州泰林生物技術(shù)股份有限公司);FC502一次性使用集菌培養(yǎng)器(中國(guó)杭州泰林生物技術(shù)股份有限公司)。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FTM，批號(hào):20190110)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號(hào):20180623)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，批號(hào):20191010)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB，批號(hào):20181223)和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號(hào):20190511)均由中國(guó)青島海博科技有限公司提供，以上培養(yǎng)基適用性檢查均符合中國(guó)藥典2015年版規(guī)定[8]。標(biāo)準(zhǔn)菌株和定量菌球:枯草芽胞桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(F)44102]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]和黑曲霉[CMCC(F)98003]由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。BioballMultishot550金黃色葡萄球菌、BioballMultishot550大腸埃希菌、BioballMultishot550枯草芽胞桿菌、BioballMultishot550白色假絲酵母和BioballMultishot550黑曲霉定量菌球均由法國(guó)梅里埃公司提供。
1.3方法
1.3.1菌液制備接種金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌至TSB中，33℃培養(yǎng)18h;接種枯草芽胞桿菌至TSA斜面，33℃培養(yǎng)18h;接種生孢梭菌至FTM中，33℃培養(yǎng)18h;接種白色念珠菌至SDB中，23℃培養(yǎng)2d;接種黑曲霉至SDA斜面，23℃培養(yǎng)7d。每種菌的新鮮培養(yǎng)物按要求稀釋制備菌懸液，分別計(jì)數(shù)，不同菌懸液每毫升含菌數(shù)均不大于100cfu。5種定量菌球均按使用說(shuō)明書(shū)分別復(fù)溶至每毫升含菌約500cfu，取菌懸液各0.1ml分別計(jì)數(shù)。
1.3.2瓶身和外蓋無(wú)菌檢查前處理研究取3批已滅菌(規(guī)格:5ml、8ml和10ml)的聚丙烯藥用滴眼劑瓶，每批產(chǎn)品取25個(gè)樣品作為供試品，每種規(guī)格的供試品均進(jìn)行低濃度人工污染金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母和黑曲霉。每種菌的接種同法操作5次，方法如下:將枯草芽胞桿菌定量菌球溶液0.1ml均勻滴灑至瓶?jī)?nèi)壁，旋上外蓋置50℃烘箱晾干;將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白色假絲酵母的定量菌球溶液各取0.1ml分別均勻滴灑至瓶?jī)?nèi)壁，之后輕旋上外蓋。
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取供試品標(biāo)示容量的洗脫液(0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液)緩慢注入已接種的樣品中，旋緊外蓋振蕩30s，將洗脫液薄膜過(guò)濾后取濾膜培養(yǎng)，作為試驗(yàn)組。取未接種菌的樣品同法操作為供試品對(duì)照組。同時(shí)取上述5種菌的菌懸液各0.1ml分別計(jì)數(shù)作為菌液組。細(xì)菌接種至TSA平板于33℃培養(yǎng)3d，霉菌和酵母菌接種至SDA平板于23℃培養(yǎng)5d。
1.3.3瓶身和外蓋無(wú)菌檢查方法適用性試驗(yàn)試驗(yàn)組:取上述三批聚丙烯藥用滴眼劑瓶的瓶身和外蓋，每批樣品取120瓶，20瓶一組分成6組。每瓶中加入標(biāo)示容量的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，旋緊外蓋振蕩30s，合并20瓶的提取液，在提取液中加入“1.3.1”項(xiàng)制備的菌懸液1ml。按照《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查方法適用性試驗(yàn)要求，6組提取液分別加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。將提取液薄膜過(guò)濾后再加FTM或TSB至濾筒中。將上述濾筒分別置規(guī)定溫度培養(yǎng)5d，觀察結(jié)果。對(duì)照組:另取裝有同體積培養(yǎng)基的濾筒，分別加入等量不同試驗(yàn)菌。同試驗(yàn)組培養(yǎng)，觀察結(jié)果。
1.3.4內(nèi)蓋無(wú)菌檢查方法適用性試驗(yàn)試驗(yàn)組:取上述三批聚丙烯藥用滴眼劑瓶的內(nèi)蓋，每批樣品取120個(gè)，20個(gè)一組分成6組。將20個(gè)內(nèi)蓋放入同一無(wú)菌瓶中，再加入FTM或TSB，并加入“1.3.1”項(xiàng)制備的菌懸液1ml。按照《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查方法適用性試驗(yàn)要求，6組提取液分別加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。將上述無(wú)菌瓶分別置規(guī)定溫度培養(yǎng)5d，觀察結(jié)果。對(duì)照組:另取裝有同體積培養(yǎng)基的濾筒，分別加入等量不同試驗(yàn)菌。同試驗(yàn)組培養(yǎng)，觀察結(jié)果。
2結(jié)果
2.1菌液計(jì)數(shù)結(jié)果取“1.3.1”項(xiàng)制備和稀釋的菌液，按平皿法測(cè)定菌落數(shù)，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株的計(jì)數(shù)結(jié)果分別為42cfu/皿、42cfu/皿、33cfu/皿、19cfu/皿、28cfu/皿、62cfu/皿，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉定量菌球的計(jì)數(shù)結(jié)果分別為47cfu/皿、47cfu/皿、48cfu/皿、44cfu/皿、52cfu/皿。
2.2瓶身和外蓋無(wú)菌檢查前處理研究結(jié)果試驗(yàn)組中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母和黑曲霉5種菌在不同規(guī)格樣品中的回收率均>80%(表1)，符合《中國(guó)藥典》中“微生物回收”的要求，表明本品的無(wú)菌檢查前處理可采用“1.3.2”項(xiàng)前處理方法。
2.3瓶身和外蓋無(wú)菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果聚丙烯藥用滴眼劑瓶瓶身和外蓋的無(wú)菌檢查適用性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)組中試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況與對(duì)照管比較，結(jié)果均生長(zhǎng)良好。表明本品瓶身和外蓋無(wú)菌檢查方法可以采用“1.3.2”項(xiàng)浸提法結(jié)合薄膜過(guò)濾法，且樣品的檢驗(yàn)量在本試驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用。
2.4內(nèi)蓋無(wú)菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果聚丙烯藥用滴眼劑瓶?jī)?nèi)蓋的無(wú)菌檢查適用性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)組中試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況與對(duì)照管比較，結(jié)果均生長(zhǎng)良好。表明本品內(nèi)蓋的無(wú)菌檢查方法可以采用直接接種法，且樣品的檢驗(yàn)量在本試驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用。
2.5聚丙烯藥用滴眼劑瓶的無(wú)菌檢查法根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，本品的取樣量可參照《中國(guó)藥典》四部通則(1101)醫(yī)療器械，內(nèi)蓋等量直接接種于各管適量培養(yǎng)基中，瓶身加入標(biāo)示容量的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將外蓋旋緊，振搖30s，合并提取液，經(jīng)薄膜過(guò)濾法處理，照無(wú)菌檢查法(《中國(guó)藥典》四部通則1101)檢查，均應(yīng)符合規(guī)定。
3討論
2015年版《國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》YBB00072002-2015中聚丙烯藥用滴眼劑瓶無(wú)菌檢查的取樣量為11個(gè)，仍按照2002年-2004年頒布的藥品包裝材料標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的取樣量取樣未進(jìn)行修訂。無(wú)菌檢查取樣量應(yīng)考慮產(chǎn)品污染率和無(wú)菌檢查“通過(guò)”率，現(xiàn)行《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查的取樣量按照上述關(guān)系確定。當(dāng)存在微生物污染時(shí)，取樣量越大，無(wú)菌檢查“通過(guò)”率就越低。鑒于取樣的代表性及科學(xué)性，本品無(wú)菌檢查的取樣量可參照《中國(guó)藥典》四部通則(1101)醫(yī)療器械，同時(shí)應(yīng)考慮滅菌劑殘留等因素可能會(huì)造成無(wú)菌檢查的假陰性，應(yīng)增加陽(yáng)性對(duì)照的取樣量。由于聚丙烯藥用滴眼劑瓶批產(chǎn)量基本都在1000瓶以上，無(wú)菌檢查取樣量參照《中國(guó)藥典》四部通則(1101)醫(yī)療器械，出廠(chǎng)檢驗(yàn)中接種每種培養(yǎng)基至少20瓶，其出廠(chǎng)檢驗(yàn)量應(yīng)為60瓶，上市監(jiān)督檢驗(yàn)量應(yīng)為30瓶。
國(guó)外藥品包裝材料的無(wú)菌檢查方法主要也是參照醫(yī)療器械實(shí)施，產(chǎn)品性狀允許的情況下，采用直接接種法，無(wú)法采用直接接種的樣品選擇浸提法結(jié)合薄膜過(guò)濾法[9-10]，國(guó)內(nèi)醫(yī)療器械的無(wú)菌檢查也參照這個(gè)原則[11-15]。由于浸提法結(jié)合薄膜過(guò)濾法存在微生物轉(zhuǎn)移損失和操作繁瑣造成假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，在藥品包裝材料性狀允許的情況下，無(wú)菌檢查方法應(yīng)優(yōu)先考慮直接接種法。聚丙烯藥用滴眼劑瓶的組成包含瓶身、外蓋和內(nèi)蓋，三部分包裝相對(duì)獨(dú)立。因構(gòu)造和規(guī)格等原因，瓶身并不適用于直接接種法，需采用浸提法結(jié)合薄膜過(guò)濾法，而內(nèi)蓋則可以采用直接接種法。由于聚丙烯藥用滴眼劑瓶的規(guī)格都相對(duì)較小，所以將洗脫液的量定為標(biāo)示容量。無(wú)菌檢查取樣量參照《中國(guó)藥典》醫(yī)療器械后取樣量是之前的數(shù)倍，若振搖洗脫時(shí)間仍采用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的1min，則60個(gè)瓶子需要振搖60min。無(wú)菌檢查振搖洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，操作繁瑣且容易造成污染，因此將每瓶的振搖時(shí)間定為30s，并進(jìn)行低濃度人工污染金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉5種代表性菌株的回收率的考察，5種菌分別代表革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、芽胞菌、酵母和霉菌。樣品前處理研究表明振搖時(shí)間30s時(shí)，每種菌的洗脫回收率均符合要求，因此可將洗脫液定為標(biāo)示容量以及振搖洗脫時(shí)間定為30s。本品內(nèi)蓋相對(duì)獨(dú)立，為減少滴眼劑瓶組裝操作帶來(lái)的污染風(fēng)險(xiǎn)，采用直接接種法進(jìn)行內(nèi)蓋的無(wú)菌檢查。無(wú)菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果證明本研究建立的無(wú)菌檢查方法適用于聚丙烯藥用滴眼劑瓶。——論文作者：周燕麗
