發(fā)布時(shí)間：2021-09-16所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要目的：建立以決明子中萘并吡喃酮類對(duì)照提取物和對(duì)照品為對(duì)照物質(zhì)的脂康顆粒含量測(cè)定方法并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討中藥對(duì)照提取物替代單體對(duì)照品在中藥復(fù)方質(zhì)量控制中應(yīng)用的適用性和可行性。方法：分別以紅鐮霉素-6-O--D-龍膽二糖苷、決明子苷B2、決明
摘要目的：建立以決明子中萘并吡喃酮類對(duì)照提取物和對(duì)照品為對(duì)照物質(zhì)的脂康顆粒含量測(cè)定方法并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討中藥對(duì)照提取物替代單體對(duì)照品在中藥復(fù)方質(zhì)量控制中應(yīng)用的適用性和可行性。方法：分別以紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷、決明子苷B2、決明子苷C、決明子苷C2這4個(gè)對(duì)照品和已知含量的決明子對(duì)照提取物為對(duì)照，采用高效液相色譜法，測(cè)定4種成分在脂康顆粒復(fù)方中的含量，并對(duì)兩種方法所得的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4種成分的含量在對(duì)照提取物法與對(duì)照品法比較下，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，說明對(duì)照提取物可以作為脂康顆粒質(zhì)量控制中的對(duì)照物質(zhì)。結(jié)論：該研究結(jié)果為萘并吡喃酮類對(duì)照提取物用于含決明子的中藥復(fù)方的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)和研究基礎(chǔ)，對(duì)中藥對(duì)照提取物代替化學(xué)對(duì)照品進(jìn)行中藥復(fù)方質(zhì)量控制的可行性和適用性進(jìn)行了驗(yàn)證。
關(guān)鍵詞決明子;對(duì)照提取物;紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷;決明子苷B2;決明子苷C;決明子苷C2;脂康顆粒;質(zhì)量控制
中藥對(duì)照提取物是中藥的“標(biāo)準(zhǔn)”提取物，是一類非單體成分對(duì)照品，一般通過特殊的提取分離工藝制備而成[1]。它具有化學(xué)成分組成相對(duì)明確、指標(biāo)成分含量確切、適合多成分分析等特點(diǎn)，可用于薄層色譜或其他色譜鑒別，以及高效液相色譜法的含量測(cè)定[2]。對(duì)照提取物首次在2005年版《中國(guó)藥典》中作為中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出現(xiàn)[3]，并且隨著藥典修訂工作的不斷推進(jìn)，有更多數(shù)量的對(duì)照提取物被收載和應(yīng)用。2020年版《中國(guó)藥典》(四部)中就收載了人參莖葉總皂苷、三七總皂苷、廣陳皮對(duì)照提取物、銀杏葉提取物等23種對(duì)照提取物[4]。美國(guó)藥典(USPharmacopoeia，USP)和歐洲藥典(EuropeanPharmacopoeia，EP)對(duì)于對(duì)照提取物也有相應(yīng)的收載和應(yīng)用[5-7]。雖然中藥對(duì)照提取物僅在對(duì)照物質(zhì)總數(shù)量中的比例并不大，但是中藥對(duì)照提取物具備一些特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，能夠彌補(bǔ)中藥化學(xué)對(duì)照品和對(duì)照藥材在生產(chǎn)、供應(yīng)、使用等環(huán)節(jié)中存在的不足，對(duì)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和檢測(cè)效率的提高具有促進(jìn)作用[8]。
中藥復(fù)方是中醫(yī)用藥的重要形式，在中醫(yī)藥醫(yī)療活動(dòng)中發(fā)揮著不可替代的作用。中藥復(fù)方的功效發(fā)揮是其所含有效成分綜合作用的結(jié)果，是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用的體現(xiàn)[9]。因此，中藥復(fù)方的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)研究應(yīng)依據(jù)其特點(diǎn)開展。近年來，中藥復(fù)方質(zhì)量控制方法研究成為中藥現(xiàn)代化的重要的研究領(lǐng)域之一[10]。為了保障中藥復(fù)方制劑的安全性與有效性，中醫(yī)藥學(xué)者開展了大量的系統(tǒng)研究，旨在建立符合中藥復(fù)方質(zhì)量特點(diǎn)的系統(tǒng)、科學(xué)、全面的質(zhì)量控制方法。
現(xiàn)階段，中藥質(zhì)量控制基本都是借鑒化學(xué)藥品的控制模式，采用單一對(duì)照品評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，這種方法由于中藥成分的多樣性及復(fù)雜性，往往具有一定的局限性。而對(duì)照提取物可以同時(shí)對(duì)多個(gè)組分進(jìn)行含量測(cè)定，體現(xiàn)了中藥整體質(zhì)量控制的思想。將中藥對(duì)照提取物應(yīng)用于中藥及中藥復(fù)方質(zhì)量控制具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：相對(duì)固定的化學(xué)組成，安全、穩(wěn)定的理化特性;專屬性較強(qiáng);可以減少化學(xué)對(duì)照品的使用，降低檢驗(yàn)成本;配制操作簡(jiǎn)單，溶解于有機(jī)溶劑后可直接使用，使藥品檢測(cè)更加簡(jiǎn)便、快捷[11]。因此，開展中藥對(duì)照提取物研究并探索將其用于中藥及中藥復(fù)方的質(zhì)量控制具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用意義，能夠解決目前中藥質(zhì)量控制研究中的諸多問題。
決明子為豆科植物鈍葉決明CassiaobtusifoliaL.或決明(小決明)CassiatoraL.的干燥成熟種子。具有清熱明目，潤(rùn)腸通便的功效。臨床常用于目赤澀痛，羞明多淚，頭痛眩暈，目暗不明，大便秘結(jié)[12]。決明子作為脂康顆粒中的重要藥味，由決明子、枸杞子、桑椹、紅花、山楂四味中藥組成，具有滋陰清肝，活血通絡(luò)的作用，臨床上可用于肝腎陰虛挾瘀所引起的高脂血癥等疾病的治療[13]。課題組前期系統(tǒng)開展了決明子萘并吡喃酮類對(duì)照提取物制備及定值研究，并將其應(yīng)用于決明子藥材的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)[14-18]。文獻(xiàn)及前期研究結(jié)果顯示，將中藥對(duì)照提取物用于中藥及中藥復(fù)方的質(zhì)量控制，穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確度高、可行性強(qiáng)[19-22]。在此基礎(chǔ)上，以脂康顆粒為例，分別采用化學(xué)對(duì)照品法和對(duì)照提取物法，建立含有決明子的中藥制劑脂康顆粒的含量測(cè)定方法，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。進(jìn)一步探討決明子萘并吡喃酮類對(duì)照提取物用于中藥復(fù)方質(zhì)量控制中的可行性和適用性，為全面評(píng)價(jià)決明子藥材及復(fù)方質(zhì)量提供研究基礎(chǔ)，為中藥對(duì)照提取物在中藥復(fù)方質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)工作中的適用性和可行性提供科學(xué)依據(jù)。
1儀器與試藥
1.1儀器循環(huán)水式多用真空泵(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：SHB-Ⅲ);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DE);高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司，美國(guó)，型號(hào)：1525型);AgilentZORBAXSB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)(安捷倫科技(中國(guó))有限公司，美國(guó)，型號(hào)：ZORBAXSB-C18);十萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司，型號(hào)：SartoriousBT25S)。
1.2試劑決明子苷B2對(duì)照品、決明子苷C2對(duì)照品、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷對(duì)照品、決明子苷C對(duì)照品由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院自制，經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定及色譜檢測(cè)計(jì)算，純度均大于98%;乙腈、甲醇為色譜純(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，美國(guó)，批號(hào)：155805);哇哈哈純凈水;甲醇為分析純(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2020121025);乙醇為分析純(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20190806);乙酸為分析純(汕頭市西隴化工廠有限公司，批號(hào)：080312)。
1.3分析樣品枸杞、桑葚、山楂、紅花4種藥材和各批次脂康顆粒樣品均由同仁堂(望京店)提供。
2方法與結(jié)果
2.1對(duì)照品用于脂康顆粒含量測(cè)定
2.1.1色譜條件色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相：甲醇乙腈(5:4)混合溶液(A)-1%乙酸水(B)等度洗脫(0~30min，19%A);流速：1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm;柱溫：35℃。混合對(duì)照品、供試品和陰性樣品色譜圖見圖1。
2.1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取決明子苷B2對(duì)照品2.75mg、決明子苷C2對(duì)照品2.35mg、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷對(duì)照品4.73mg、決明子苷C對(duì)照品7.96mg，置于50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液A。精密吸取3mL混合對(duì)照品溶液A，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液B;精密吸取3mL混合對(duì)照品溶液B，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液C;重復(fù)以上步驟直至制得混合對(duì)照品溶液E。
2.1.3供試品溶液的制備精密稱定脂康顆粒1g，加入50mL水溶解，上樣于內(nèi)徑為2cm，高度為25cm的大孔吸附樹脂柱，柱體積為80mL，先用320mL20%乙醇洗脫除雜后，再用480mL50%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加30%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
2.1.4陰性樣品溶液的制備取枸杞、桑葚、山楂、紅花4味藥材適量，按照處方3:3:3:1的比例，加水煎煮二次，第一次1.5h，第二次1h，濾過，濾液合并，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.05~1.10(60℃)的浸膏，加入麥芽糊精適量，混勻，噴霧干燥;浸膏粉中加入麥芽糊精適量和硬脂酸鎂5g，混勻，干法制粒，即得陰性樣品。按供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。
2.1.5線性關(guān)系考察精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液A~F各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。決明子苷B2線性范圍為0.004455~0.55μg;決明子苷C2線性范圍為0.003807~0.47μg;紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷線性范圍為0.0076626~0.946μg決明子苷C線性范圍為0.012895~1.592μg。
2.1.6儀器精密度試驗(yàn)分別精密稱取同一供試品溶液6份，每次進(jìn)樣10μL，以色譜峰峰面積，計(jì)算RSD分別為0.58%、0.87%、0.90%、0.79%，RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。
2.1.7中間精密度試驗(yàn)分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法由不同的分析人員在不同的時(shí)間制備脂康顆粒樣品溶液，分別采用Waters1525-2998-2707和Waters1525-2489高效液相色譜儀測(cè)定峰面積。決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷及決明子苷C的含量分別為0.080%(RSD=0.77%)，0.010%(RSD=1.20%)，0.152%(RSD=0.93%)，0.042%(RSD=1.05%)，表明該方法中間精密度良好。
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2.1.8供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，16，24h進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰峰面積。計(jì)算RSD分別為1.01%，0.72%，1.23%和0.57%。表明該溶液在制備后24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.9重復(fù)性試驗(yàn)分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。RSD值均小于3%，表明重復(fù)性良好。
2.1.10回收率試驗(yàn)分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份0.5g，加入對(duì)照品溶液適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見表1，RSD均小于3%，表明回收率良好。
2.2對(duì)照提取物用于脂康顆粒含量測(cè)定
2.2.1色譜條件采用“2.1.1”項(xiàng)條件，對(duì)照提取物、供試品及陰性樣品溶液色譜圖見圖2。
2.2.2對(duì)照提取物溶液的制備精密稱取已標(biāo)定含量的決明子萘并吡喃酮類對(duì)照提取物12.88mg，置于25mL容量瓶中，加30%甲醇超聲溶解，靜置，定容，搖勻，即得對(duì)照提取物溶液A。精密吸取3mL對(duì)照提取物溶液A于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對(duì)照提取物溶液B;精密吸取3mL對(duì)照提取物溶液B于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對(duì)照提取物溶液C;重復(fù)以上步驟直至制得對(duì)照提取物溶液E。
2.2.3供試品溶液的制備精密稱定脂康顆粒1g，加入50mL水溶解，上樣于內(nèi)徑為2cm，高度為25cm的大孔吸附樹脂，柱體積為80mL，320mL20%乙醇洗脫除雜后，用480mL50%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
2.2.4陰性樣品溶液的制備取枸杞、桑葚、山楂、紅花4味藥材適量，按照處方3:3:3:1的比例，加水煎煮二次，第一次1.5h，第二次1h，濾過，濾液合并，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.05~1.10(60℃)的浸膏，加入麥芽糊精適量，混勻，噴霧干燥;浸膏粉中加入麥芽糊精適量和硬脂酸鎂5g，混勻，干法制粒，即得陰性樣品。按“2.1.3”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。
2.2.5線性關(guān)系考察精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照提取物溶液A~F各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。決明子苷B2線性范圍為0.004455~0.55μg;決明子苷C2線性范圍為0.003807~0.47μg;紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷線性范圍為0.0076626~0.946μg決明子苷C線性范圍為0.012895~1.592μg。
2.2.6儀器精密度試驗(yàn)分別精密稱取同一供試品溶液6份，每次進(jìn)樣10μL，以色譜峰峰面積，計(jì)算RSD分別為0.74%、0.91%、0.85%、1.20%，RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。
2.2.7中間精密度試驗(yàn)分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法由不同的分析人員在不同的時(shí)間制備脂康顆粒樣品溶液，分別采用Waters1525-2998-2707和Waters1525-2489高效液相色譜儀測(cè)定峰面積。決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷及決明子苷C的含量分別為0.081%(RSD=0.91%)，0.010%(RSD=1.23%)，0.151%(RSD=0.95%)，0.040%(RSD=1.02%)，表明該方法中間精密度良好。
2.2.8供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，16，24h進(jìn)樣，測(cè)定4種指標(biāo)性成分的色譜峰峰面積，計(jì)算RSD分別為1.10%，1.43%，0.97%和1.24%。表明該溶液在制備后24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.9重復(fù)性試驗(yàn)分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。RSD值均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.2.10回收率試驗(yàn)分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份0.5g，加入對(duì)照提取物溶液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見表2，RSD均小于3%，表明回收率良好。
2.3復(fù)方脂康顆粒含量測(cè)定
精密稱取12批脂康顆粒粉末，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別以4個(gè)對(duì)照品和已知含量的決明子對(duì)照提取物為對(duì)照，采用高效液相色譜法，測(cè)定4種成分的含量，并對(duì)不同方法所得的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷和決明子苷C的P值分別為0.233、0.082、0.192、0.198，P值均大于0.05，說明對(duì)照提取物可以作為脂康顆粒質(zhì)量控制中的對(duì)照物質(zhì)，代替相應(yīng)的化學(xué)對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。——論文作者：張顏周德勇王路高艷艷林天鳳劉斌姜艷艷
