發(fā)布時(shí)間：2020-01-09所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要 對 8 株分離自廣州市售海產(chǎn)品中的副溶血弧菌菌株進(jìn)行鑒定，并分析了其耐藥性。于 2017 年 4 ～ 5 月采集市售海產(chǎn)品，按照國標(biāo)法對其中的副溶血弧菌進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行 16S rDNA 同源性比較。采用 K-B 紙片法和結(jié)晶紫染色法分別評估了副溶血弧菌菌株
摘 要 對 8 株分離自廣州市售海產(chǎn)品中的副溶血弧菌菌株進(jìn)行鑒定，并分析了其耐藥性。于 2017 年 4 ～ 5 月采集市售海產(chǎn)品，按照國標(biāo)法對其中的副溶血弧菌進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行 16S rDNA 同源性比較。采用 K-B 紙片法和結(jié)晶紫染色法分別評估了副溶血弧菌菌株對 20 種常見抗生素的藥物敏感性及其生物膜形成能力。結(jié)果表明，8 株分離菌株對多粘菌素 B、頭孢他啶、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、萘啶酸這 8 種抗生素均為敏感，對青霉素、萬古霉素 2 種抗生素均顯示耐藥，對其他 10 種抗生素有不同程度的耐藥性。相比 ATCC 17802 菌株，分離菌株多重耐藥性更為顯著，耐抗生素?cái)?shù)量為 3 ～ 10 種。分析菌株的生物膜形成能力，發(fā)現(xiàn)其耐藥性與生物膜形成能力呈正相關(guān)。海產(chǎn)品中副溶血弧菌耐藥性普遍且多重耐藥性顯著的現(xiàn)象，應(yīng)該予以廣泛關(guān)注和重視。
關(guān)鍵詞 海產(chǎn)品; 副溶血弧菌; 鑒定; 耐藥性; 生物膜
副溶血弧菌是一種常見的嗜鹽性革蘭氏陰性菌，適宜生長 2. 5% ～ 3% 的鹽溶液中，主要分布于海水及魚、蝦、蟹、貝等海產(chǎn)食品中，是引起海鮮類食物中毒的主要原因[1 - 3]。據(jù)報(bào)道，在亞洲，尤其是在中國、日本、韓國，因?yàn)樯院ｕr而引起的副溶血弧菌食物中毒事件頻頻發(fā)生[4 - 5]。2003 - 2005 年廣東省水產(chǎn)品污染狀況調(diào)查顯示，431 份樣品中有 156 份檢出副溶血性弧菌，總檢出率為 36. 19%[6]。2008 年上海的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，副溶血弧菌是導(dǎo)致夏秋季腹瀉的主因，門診腹瀉患者肛拭檢測副溶血性弧菌陽性率為 2. 95% ，遠(yuǎn)高于沙門菌( 0. 53% ) ，位居首位[7]。2016 年唐山市調(diào)查顯示，采集的 204 份海產(chǎn)品中，副溶血性弧菌陽性檢出率為 32. 84%[8]。副溶血弧菌攜帶 tdh、trh 毒力基因，人感染后會導(dǎo)致急性腸胃炎，臨床癥狀為腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心、低燒[9]。
由于抗生素的長期、不合理使用以及缺乏有效監(jiān)管，病原菌的耐藥性越來越強(qiáng)，且出現(xiàn)多重耐藥性問題。近年來，多種“超級細(xì)菌”不斷被發(fā)現(xiàn)，引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[10]。2010 年 8 月《柳葉刀》報(bào)道了英國卡迪夫大學(xué)醫(yī)學(xué)院蒂莫西教授發(fā)現(xiàn)的攜帶新德里一號金屬酶( NDM-1) 基因的細(xì)菌，這是繼 MRSA 之后發(fā)現(xiàn)的又一超級耐藥細(xì)菌[11]。耐藥感染性疾病已成為當(dāng)前臨床感染性疾病死亡的主要原因[12]。海產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素的濫用也導(dǎo)致了副溶血弧菌耐藥性的增強(qiáng)，使得抗生素的藥敏性大大下降甚至消失，從而導(dǎo)致臨床治療副溶血弧菌感染病癥難度變大，成本增加。
生物膜( biofilm) 是單一或混合的微生物聚集、附著于物體表面上生長繁殖，并包被在自身分泌的胞外聚合物中而形成的類膜結(jié)構(gòu)的聚合體[13 - 14]。生物膜能夠使細(xì)菌免受宿主的獲得性免疫應(yīng)答以及吞噬細(xì)胞的捕食，使其耐藥性提高 10 ～ 1 000 倍[15]。本研究對廣州市售海產(chǎn)品中的副溶血弧菌進(jìn)行分離鑒定，并分析了其耐藥性及生物膜形成能力，旨在為海產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制以及防治副溶血弧菌感染提供理論依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 標(biāo)準(zhǔn)菌株與材料
副 溶 血 弧 菌 ( Vibrio parahaemolyticus ) ATCC 17802、大腸桿菌( Escherichia coli) ATCC 25922 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。魚、蝦、蛤、蠔等海產(chǎn)品采集于廣州市區(qū)超市及農(nóng)貿(mào)市場。氧化酶試紙、副溶血弧菌生化檢測試劑盒購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。
1. 1. 2 藥敏紙片
20 種常用抗生素的藥敏檢測紙片，包括青霉素 ( PEN，10 μg) 、氨芐西林( AMP，10 μg) 、氨芐西林/舒巴坦( AMS，10 μg) 、美羅培南( MEM，10 μg) 、多粘菌素 B( PB，300 μg) 、萬古霉素( VAN，30 μg) 、頭孢噻吩( CEP，30 μg) 、頭孢他啶( CAZ，30 μg) 、慶大霉素 ( GEN，10 μg ) 、卡 那 霉 素 ( KAN，30 μg ) 、鏈 霉 素 ( STR，10 μg ) 、四 環(huán) 素 ( TET，30 μg ) 、強(qiáng) 力 霉 素 ( DOX，30 μg) 、氯霉素( CHL，30 μg) 、乙酰螺旋霉素 ( ASP，30 μg) 、紅霉素( ERY，15 μg) 、環(huán)丙沙星( CIP， 5 μg) 、萘啶酸( NA，30 μg) 、利福平( RIF，5 μg) 、復(fù)方新諾明( SXT，23. 75 /1. 25 μg) ，購于杭州市微生物試劑有限公司。
1. 1. 3 溶液及培養(yǎng)基
質(zhì)量濃度為 1 g /L 結(jié)晶紫溶液; 體積分?jǐn)?shù)為 33% 冰乙酸溶液: 量取 100 mL 冰乙酸，加入到 200 mL 去離子水中。
含質(zhì)量濃度為30 g /L NaCl 的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基( TSB) : 胰蛋白胨 15 g、大豆蛋白胨 5 g、NaCl 30 g、去離子水 1 L。用 1 mol /L NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 為 7. 0 ～ 7. 4; 121 ℃，0. 15 MPa 下高壓滅菌 15 min。
含 30 g /L NaCl 的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基( TSA) : 在上述 TSB 配方的基礎(chǔ)上加入1. 5% 的瓊脂，加熱融化后滅菌。
含 30 g /L NaCl 的堿性蛋白胨水、TCBS 培養(yǎng)基、 3% 氯化鈉三糖鐵瓊脂、MR-VP 培養(yǎng)基、MHB 培養(yǎng)基均購于廣東環(huán)凱微生物微生物科技有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 樣品采集及處理
從廣州市各區(qū)的 14 個超市及農(nóng)貿(mào)市場采集市售的魚、蝦、蛤、蠔等海產(chǎn)品，用無菌采樣袋裝好后放入冰盒裝中返校，確保在 2 h 內(nèi)處理樣品。魚取表面組織、腮、腸; 蝦( 甲殼類) 用自來水洗凈后取整個動物，包括腸和腮; 蛤和蠔( 貝類) 用自來水沖洗干凈后取內(nèi)容物。取樣時(shí)均為無菌操作方式。
1. 2. 2 副溶血弧菌的分離鑒定
菌株分離鑒定: 按照 GB 4789. 7—2013 中副溶血弧菌檢驗(yàn)方法，樣品在質(zhì)量濃度為 30 g /L 氯化鈉堿性蛋白胨水中增菌后，劃線分離于 TCBS 平板中，挑取可疑單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗(yàn)、3% 氯化鈉三糖鐵瓊脂試驗(yàn)、嗜鹽性試驗(yàn)，并利用副溶血弧菌生化檢測試劑盒進(jìn)行生化鑒定，包括 30 g /L 氯化鈉甘露醇、3% 氯化鈉賴氨酸脫羧酶、ONPG 和 MR- VP 試驗(yàn)。
16S rDNA 測序: 生化試驗(yàn)陽性菌株進(jìn)行 16S rDNA 同源性比較分析。菌株在 TSB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜后，用細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒提取基因組 DNA，于 - 20 ℃中保存?zhèn)溆谩；蚪M DNA 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，所用引物為 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1495R: 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA- 3’。擴(kuò)增體系為: 無菌水 10. 5 μL，混合引物 1 μL， taq PCR Master Mix 12. 5 μL，DNA 模板 1 μL。其中混合引物為 1 μL 27f、1 μL 1492r 和 8 μL 無菌水。 PCR 反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性 5 min( 95 ℃ 變性 1 min， 54 ℃復(fù)性 1 min，72 ℃ 延伸 2 min) ，30 個循環(huán)，72 ℃ 保溫 10 min。擴(kuò)增后的 DNA 經(jīng)檢驗(yàn)送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。將 16S rDNA 基因測序結(jié)果通過 BLAST 在 GenBank 中進(jìn)行同源比對分析。
1. 2. 3 菌株的耐藥性分析
將副溶血弧菌分離菌株、ATCC 17802 菌株和質(zhì)控菌株大腸埃希菌 ATCC 25922 分別接種于 TSB 和 LB 培養(yǎng)基中，于 120 r/min 的搖床內(nèi) 37 ℃活化 12 h。培養(yǎng)液于 4 000 r/min 離心 10 min，收集菌體，用生理鹽水 10 倍稀釋至濃度為 108 CFU/mL。
取 100 μL 菌液在 MH 瓊脂平板中，涂布均勻。干燥數(shù)分鐘后，用無菌鑷子夾取 20 種常用抗生素紙片輕輕放置在平板中，紙片間距不小于 24 mm，距離平板邊緣不小于 15 mm。平行實(shí)驗(yàn) 3 次。將平板倒置于培養(yǎng)箱中，37 ℃下培養(yǎng)18 h 后，用標(biāo)準(zhǔn)直尺測量抑菌圈大小，根據(jù)參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會 ( Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)推薦的紙片擴(kuò)散法及判定標(biāo)準(zhǔn)[16]、杭州微生物試劑有限公司提供的產(chǎn)品說明書整理出的標(biāo)準(zhǔn)( 表 1) 判定結(jié)果。
1. 2. 4 結(jié)晶紫染色法測定生物膜形成量
將副溶血弧菌 TSB 培養(yǎng)液離心后收集菌體用 TSB 培養(yǎng)基 10 倍稀釋至濃度為 106 CFU/mL; 分別在 96 孔板中每孔加入 200 μL 菌液; 封蓋后用保鮮膜包好，在 37 ℃下靜置培養(yǎng) 24 h; 將孔板中的培養(yǎng)液去除，使用多道移液槍在每孔中加入 250 μL 無菌生理鹽水清洗 3 遍，去除浮游菌; 60 ℃ 干燥 15 min; 在干燥后的孔板中加入 200 μL 質(zhì)量濃度為 1 g /L 的結(jié)晶紫溶液，染色 10 min; 棄去結(jié)晶紫溶液，使用無菌生理鹽水清洗 3 遍，繼續(xù)干燥 15 min; 在每孔中加入 200 μL、33% 冰乙酸，靜置 10 min 后，使用 Multiskan FC 酶標(biāo)儀( Thermo，USA) 測量 OD595值[17]。
2 結(jié)果與分析
2. 1 海產(chǎn)中副溶血弧菌的分離鑒定
從廣州市區(qū)的超市及農(nóng)貿(mào)市場采集市售海產(chǎn)品，隨即進(jìn)行樣品處理，增菌 18 h 后進(jìn)行 TCBS 平板劃線分離、革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗(yàn)、質(zhì)量濃度為 30 g /L 的氯化鈉三糖鐵試驗(yàn)、嗜鹽性試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離菌株在 TCBS 培養(yǎng)基中菌落為綠色( 圖 1) ，鏡檢為短弧狀的桿菌( 圖 2) 。
氧化酶試驗(yàn)呈陽性，具有嗜鹽性。對 8 株菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)和 16S rDNA 同源性比較，鑒定為副溶血弧菌菌株( 表 2) 。
2. 2 分離菌株的耐藥性分析
測定副溶血弧菌分離菌株和 ATCC 17802 菌株對常用 20 種抗生素的藥敏結(jié)果如表 3、圖 3 所示。結(jié)果表明，8 株分離菌株對青霉素類、β-內(nèi)酰胺類、青霉烯類的抗生素抗性很強(qiáng)，對氨基糖苷類、四環(huán)素類、苯丙醇類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、安莎霉素類、葉酸代謝途徑抑制劑等抗生素較為敏感。其中對青霉素、萬古霉素 2 種抗生素均顯示耐藥性; 對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻吩耐藥的菌株也達(dá)到 7 株，對紅霉素、環(huán)丙沙星、萘啶酸等抗生素均敏感，對卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明具有耐藥性的菌株比較少，有 1 ～ 2 株，說明這些抗生素表現(xiàn)出對副溶血弧菌分離菌株較強(qiáng)的抑制作用。此外，只有 8 號菌株的耐藥性弱于 ATCC 17802 菌株，大部分分離菌株耐抗生素的種類更多。
2. 3 菌株的多重耐藥性分析
通過分析發(fā)現(xiàn)，所有菌株都存在多重耐藥性，且耐抗生素種類都在 3 ～ 10 種，多重耐藥性主要發(fā)生于青霉素類、β - 內(nèi)酰胺類、青霉烯類之間( 圖4) 。由此可見副溶血弧菌分離菌株多重耐藥性很強(qiáng)。同時(shí)， ATCC 17802 菌株也具有多重耐藥性，耐抗生素種類為 5 種。其中來源于鱸魚、蝦體內(nèi)的分離菌株多重耐藥性很強(qiáng)，2 號菌株耐藥性最強(qiáng)，耐抗生素種類高達(dá) 10 種，1、4、5、7 號菌株耐抗生素8 種以上，均比 ATCC 17802 菌株多。僅有來源于蛤的 8 號菌株耐 3 種抗生素，多重耐藥性相對 ATCC 17802 菌株較弱。在對多重耐藥譜分析中發(fā)現(xiàn)，來源于蝦體內(nèi)的 4、5 號菌株耐抗生素都是 8 種，且兩者只有 1 種抗生素差別; 來源于魚的 1、2、6、7 號菌株的多重耐藥無論數(shù)量還是種數(shù)差異都比較大( 表 4) 。
3 結(jié)論與討論
3. 1 菌株耐藥性差異分析
副溶血弧菌耐藥性具有時(shí)空特性，不同地區(qū)的菌株具有不同的耐藥性。這是由于每個地區(qū)使用抗生素種類、劑量和菌群特異性導(dǎo)致的。本研究的結(jié)果表明，市售海產(chǎn)品中 8 株副溶血弧菌分離菌株對青霉素、萬古霉素 2 種抗生素顯示完全耐藥; 對美羅培南、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻吩、利福平這 5 種抗生素具有非常普遍的耐藥性，耐藥菌株在 5 株以上; 對卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明 5 種抗生素耐藥性很低，對多粘菌素 B、頭孢他啶、慶大霉素、氯霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、萘啶酸等抗生素均敏感。同為廣州市海產(chǎn)品中副溶血弧菌分離菌株，冼鈺茵等[18]的研究表明，其對萬古霉素、氨芐西林、鏈霉素的耐藥率分別 為 100% 、77. 01% 和 85. 06% ，對利福平、慶大霉素、紅霉素、頭孢噻吩、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星的耐藥率在 5% 及以下。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有比較高的一致性，但又在頭孢噻吩、利福平這 2 種抗生素上存在區(qū)別。說明同地區(qū)的副溶血弧菌耐藥性也不盡相同。而由于不同地區(qū)抗生素使用數(shù)量和劑量的差別、菌群差別，在國內(nèi)的其他地區(qū)或國外地區(qū)，副溶血弧菌耐藥性差異更大。盧奕等[19]研究表明，上海市水產(chǎn)品中副溶血弧菌對卡那霉素、多粘菌素 B、環(huán)丙沙星的耐藥性很高，對氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻吩、萬古霉素、利福平的耐藥性非常低，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不同。分離菌株對同一類抗生素的耐藥性不同。如萬古霉素和多粘菌素 B 都是糖肽類抗生素，頭孢噻吩和頭孢他啶都是頭孢類抗生素，由于前者是第一代藥物，后者是第三代藥物，副溶血弧菌對前者耐藥性明顯比后者強(qiáng)。不同來源的副溶血弧菌菌株的耐藥性也不同，本研究發(fā)現(xiàn)，來源于魚和蝦的 7 株菌多重耐藥性強(qiáng)，耐抗生素種類為 5 ～ 10 種。相比較而言，來源于蛤的 8 號菌株，多重耐藥性較弱，耐抗生素為 3 種。
3. 2 細(xì)菌生物膜與耐藥性
細(xì)菌生物膜是細(xì)菌生存的一種重要機(jī)制，它增強(qiáng)了細(xì)菌對不良環(huán)境的耐受力，尤其是耐藥性。生物膜阻礙隔絕抗生素的進(jìn)入，同時(shí)為膜內(nèi)細(xì)胞的生存及相互交流提供穩(wěn)定環(huán)境[20 - 21]。同時(shí)，生物膜外排泵系統(tǒng)[22]、特定基因變化引起的應(yīng)激反 應(yīng)[23]、群 體 感應(yīng)[24]、膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性下降[25]也是其耐藥機(jī)制。本研究分析副溶血弧菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其生物膜形成能力發(fā)現(xiàn)，兩者之間存在正相關(guān)。其中，1、2、3、4、 5、7 號菌株生物膜形成能力比較強(qiáng)，其多重耐藥性也非常顯著，耐抗生素種類為 7 ～ 10 種; 6 號和 8 號菌株生物膜形成能力比較差，耐抗生素種類分別為 5 種和 3 種。與標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC 17802 相比，6 號和 8 號菌株在形成生物膜能力差異相對小，其多重耐藥性的差異也 不 大，而其他菌株生物膜形成能力極顯著 ( p < 0. 01) 強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，其多重耐藥性也十分顯著。有研究表明生物膜細(xì)菌對次氯酸的抗性比浮游菌強(qiáng) 15 ～ 3 000 倍[26]，致病性大腸桿菌對環(huán)丙沙星及氟苯 尼 考 的 耐 藥 性 與 生 物 膜 形 成能力呈正相關(guān)[27]。
期刊推薦：《食品與發(fā)酵工業(yè)》(月刊)1970年創(chuàng)刊，是全國眾多食品刊物中由國家一級學(xué)會創(chuàng)辦的、代表我國現(xiàn)代食品與發(fā)酵科學(xué)技術(shù)發(fā)展水平的純學(xué)術(shù)期刊，刊載內(nèi)容主要有：食品與發(fā)酵工業(yè)發(fā)展相關(guān)的原輔料、工藝、包裝、機(jī)械、檢測、安全、流通、綜合利用等方面的研究報(bào)告以及國內(nèi)外食品與發(fā)酵科技發(fā)展動態(tài)等方面的綜述文章。讀者對象為從事食品與發(fā)酵及相關(guān)行業(yè)的生產(chǎn)、科研、設(shè)計(jì)和管理的人員。
