發(fā)布時(shí)間：2020-01-10所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：目的：通過對(duì)礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃[ACAS-PT551(2018)]，確保南平市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心微生物實(shí)驗(yàn)室具備檢驗(yàn)該菌的能力，出具公平公正、合法有效的檢驗(yàn)檢測(cè)報(bào)告。方法：依據(jù)能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行快速篩
摘 要：目的：通過對(duì)礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃[ACAS-PT551(2018)]，確保南平市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心微生物實(shí)驗(yàn)室具備檢驗(yàn)該菌的能力，出具公平公正、合法有效的檢驗(yàn)檢測(cè)報(bào)告。方法：依據(jù)能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行快速篩查，同時(shí)按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB8538-2016法對(duì)兩個(gè)盲樣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：兩種方法皆顯示這兩個(gè)盲樣中存在銅綠假單胞菌，樣品18-U262報(bào)出值為4600CFU/250mL，樣品18-N396報(bào)出值為2200CFU/250mL。結(jié)論：本次試驗(yàn)Z值分別為0.3和0.5，|Z|均小于2，評(píng)價(jià)結(jié)果滿意，說明本實(shí)驗(yàn)室具備檢驗(yàn)該菌的能力;同時(shí)兩種方法結(jié)果一致，說明實(shí)時(shí)熒光定量PCR法可輔助國(guó)標(biāo)法進(jìn)行快速篩查，提高檢測(cè)效率。
關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌;能力驗(yàn)證;實(shí)時(shí)熒光定量PCR
銅綠假單胞菌(Pseudomonasaernginosa)又稱綠膿桿菌，是一種常見的食源性和水源性致病菌，它極易在水中及含水量較高的食品中存活并繁殖，對(duì)消毒劑、紫外線等理化因素具有很強(qiáng)的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病[1-3]。因此，準(zhǔn)確而快速地檢出銅綠假單胞菌，在保障人民飲食用水安全和評(píng)價(jià)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)?zāi)芰Ψ矫婢惋@得尤為重要。能力驗(yàn)證是一種有效確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的方法，同時(shí)對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平的提高和質(zhì)量管理體系的完善起到積極的作用[4]。目前，銅綠假單胞菌的檢測(cè)主要采用國(guó)標(biāo)法，檢測(cè)時(shí)間至少2d，且對(duì)操作人員的技術(shù)要求很高，不利于快速檢測(cè)。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR由于檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、且特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)而被廣泛的運(yùn)用于病毒和食源性致病菌的檢測(cè)。參加本次能力驗(yàn)證旨在通過對(duì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)，確定本實(shí)驗(yàn)室具備檢測(cè)該菌的能力，同時(shí)通過對(duì)比分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR法以及國(guó)標(biāo)法的檢測(cè)結(jié)果，為今后水中銅綠假單胞菌的快速、高效、準(zhǔn)確檢測(cè)提供有價(jià)值的參考和借鑒。
1 材料與方法
1.1 樣品來源和標(biāo)準(zhǔn)菌株
樣品18-U262和樣品18-N396，由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供。標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌(FSCC206004)和熒光假單胞菌(GDMCC1.344)，均從廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心購(gòu)買。
1.2 主要儀器
CFX96-TouchDeepWellTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Centrifuge5418臺(tái)式離心機(jī)、CHB-T2-B恒溫金屬浴、ND-ONE-W超微量分光光度計(jì)、2018614渦旋混合器、SHP-350生化培養(yǎng)箱、G154DW立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器、HTY-305G微生物限度檢驗(yàn)儀、ZF-1三用紫外分析儀以及AC2-4S1生物安全柜等。
1.3 主要試劑
綠膿桿菌核酸測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司;營(yíng)養(yǎng)肉湯、CN瓊脂及配套試劑、綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基等，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
1.4 樣品的制備
將樣品用520mL無菌水再水化，制成待測(cè)樣品原液。取待測(cè)樣品原液60mL加入到540mL的無菌水中制成1∶10的樣品勻液;按相同的方法制備1∶100、1∶1000的樣品勻液，備用。
1.5 銅綠假單胞菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法
取25mL待測(cè)樣品原液通過孔徑0.45μm的濾膜過濾，將濾膜轉(zhuǎn)移至100mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，增菌18h后，取增菌液1.5mL，13000r·min-1離心2min;棄上清液，沉淀中直接加入100μLDNA提取液充分混勻，沸水浴10min。13000r·min-1離心5min，取上清液備用。DNA的擴(kuò)增根據(jù)上海之江生物科技股份有限公司綠膿桿菌核酸測(cè)定試劑盒(熒光PCR法)的說明書進(jìn)行。
1.6 銅綠假單胞菌的國(guó)標(biāo)法
根據(jù)GB8538-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法的銅綠假單胞菌-濾膜法，將250mL水樣或稀釋液通過孔徑0.45μm的濾膜過濾，然后將濾膜平鋪在制備好的CN瓊脂平板上,將平板倒置于36℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果;同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照[5]。
2 結(jié)果與分析
2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果
用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)2份待測(cè)樣，結(jié)果2份待測(cè)樣品均檢出銅綠假單胞菌，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，樣品18-U262和樣品18-N396的樣品經(jīng)過PCR擴(kuò)增出的曲線和內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照樣的曲線一致，F(xiàn)AM通道的Ct值均≤35，說明檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。
2.2 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法檢測(cè)結(jié)果
按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB8538-2016法對(duì)2份待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在CN平板上的菌落形態(tài)如下：陽(yáng)性對(duì)照組有藍(lán)綠色菌落生長(zhǎng)，陰性對(duì)照組有黃綠色菌落生長(zhǎng);樣品18-U262和樣品18-N396的樣品有藍(lán)綠色菌落和其他菌落生長(zhǎng)，挑取藍(lán)綠色菌落，通過綠膿菌素試驗(yàn)，被檢物里面均存在綠膿菌素，判定檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，計(jì)數(shù)所有藍(lán)綠色菌落，結(jié)果見表1。樣品18-U262的報(bào)出值為4600CFU/250mL，樣品18-N396的報(bào)出值為2200CFU/250mL。
3 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)室通過參加由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織和負(fù)責(zé)實(shí)施的對(duì)2份礦泉水盲樣中銅綠假單胞菌的檢測(cè)能力驗(yàn)證，樣品18-U262的檢測(cè)結(jié)果為4600CFU/250mL，樣品18-N396的檢測(cè)結(jié)果為2200CFU/250mL，評(píng)價(jià)中心按照ISO13528-2015標(biāo)準(zhǔn)，利用參加實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果計(jì)算了能力評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)量得出本次試驗(yàn)的Z值分別為0.5和0.3，能力評(píng)價(jià)準(zhǔn)則結(jié)果|Z|均小于2，評(píng)價(jià)結(jié)果滿意，說明本實(shí)驗(yàn)室具有檢驗(yàn)該菌的能力。
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在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與國(guó)標(biāo)法對(duì)銅綠假單胞菌的檢出結(jié)果皆為陽(yáng)性，該方法與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法相比具有取樣量小，檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因此，可將qPCR法輔助國(guó)標(biāo)法對(duì)水中的銅綠假單胞菌進(jìn)行快速檢測(cè)和結(jié)果初篩，提高其檢測(cè)效率，同時(shí)也為其他微生物的快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)提供有價(jià)值的參考和借鑒。
