發(fā)布時間：2020-02-17所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：95% 乙醇室溫浸提，50 ℃減壓濃縮后得到無醇水液，用乙酸乙酯除脂后，得到血三七的除脂醇提液。將此除脂醇提液濾膜過濾后，通過制備液相分離，分得一個單一組分，將該單一組分濃縮后結(jié)晶，得到單體化合物。通過質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)鑒定單體化合物的結(jié)
摘 要：95% 乙醇室溫浸提，50 ℃減壓濃縮后得到無醇水液，用乙酸乙酯除脂后，得到血三七的除脂醇提液。將此除脂醇提液濾膜過濾后，通過制備液相分離，分得一個單一組分，將該單一組分濃縮后結(jié)晶，得到單體化合物。通過質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)鑒定單體化合物的結(jié)構(gòu)為巖白菜素。以維生素 C 作為陽性對照，采用清除 DPPH 自由基試驗方法研究化合物的抗氧化活性。結(jié)果顯示，巖白菜素清除 DPPH 自由基的抗氧化的體系終濃度 IC50 為 0.245 µg/mL，低于維生素 C 的體系終濃度(IC50 為 0.575 µg/mL)，表明巖白菜素具有較強(qiáng)的抗氧化活性。
關(guān)鍵詞：血三七;巖白菜素;抗氧化活性;機(jī)理
血 三 七 是 蓼 科 植 物 中 華 抱 莖 蓼(Polygonum amplexicaule var. sinense)的干燥根莖 [1]，具有清熱解毒、止痛散瘀和止血的功效，可用于治療骨折、外傷出血、跌打損傷等 [2]，為苗族和土家族常用藥。現(xiàn)代藥理研究表明，血三七具有抗氧化 [3]、抗菌 [4] 和治療動脈粥樣硬化 [5] 等多種藥理作用。目前，血三七的化學(xué)成分研究表明，血三七主要含有黃酮類、蒽醌類及酚酸類化合物 [6]，這些化合物分別具有抗氧化 [3]、抗病毒 [7]、抗菌 [8] 和鎮(zhèn)痛 [9] 等多種作用。
為了進(jìn)一步研究血三七的化學(xué)成分，以血三七粉末為原料，采用 95% 乙醇室溫浸提，50 ℃減壓濃縮后得到無醇水液，用乙酸乙酯除脂后，得到血三七的除脂醇提液。將此除脂醇提液濾膜過濾后，通過制備液相分離，得一單一組分，將該單一組分濃縮后結(jié)晶，得到單體化合物。通過核磁共振技術(shù)鑒定該單體化合物為巖白菜素，并以維生素 C 作為陽性對照，采用清除 DPPH 自由基試驗方法研究該化合物的抗氧化活性，探討了其抗氧化機(jī)理，展望巖白菜素作為抗氧化劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
血三七，購自安徽亳州中藥材市場。DPPH(1,1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼)，購自北京中生瑞泰科技有限公司。維生素 C，購自上海源葉生物科技有限公司。RE-301 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南鞏義瑞德儀器廠)， Waters 色譜儀，GeLai 制備液相色譜，Varian INOVA 400 核磁共振譜儀。
1.2 試驗方法
1.2.1 巖白菜素的提取與制備
將 2.00 kg 干 燥 的 血 三 七 根 粉 碎，用 6 L 乙 醇(95%)室溫浸泡提取 72 h，過濾;濾渣再次用 6 L 乙醇(95%)室溫浸泡提取 72 h，過濾，合并濾液。在減壓及 50 ℃條件下濃縮濾液至無醇水液;然后用 500 mL 乙酸乙酯萃取兩次，除去脂溶性成分，得到血三七的除脂醇提液。將該除脂醇提液過濾處理，經(jīng)中壓制備液相色譜儀制備分離，按照各峰收集洗脫液，濃縮各洗脫液至干，甲醇溶解，放置結(jié)晶，待晶體析出，過濾，即得到純品化合物，并以分析液相檢測該化合物的純度。
1.2.2 巖白菜素的結(jié)構(gòu)鑒定
以氘代甲醇為溶劑，用 Varian INOVA 400 核磁共振譜儀進(jìn)行核磁測試，解析核磁共振氫譜和碳譜圖，得到化合物的結(jié)構(gòu)。
1.2.3 抗氧化性能的測定
根據(jù)文獻(xiàn) [10]，采用 DPPH 清除率法，以維生素 C 為陽性對照，研究純品化合物巖白菜素的抗氧化活性。
1.2.4 數(shù)據(jù)分析
抗氧化性能的測定試驗中，以維生素 C 作為陽性對照，以空白為分光光度計調(diào)零，做 3 組重復(fù)，抗氧化性能取 3 組實驗的平均值。
2 結(jié)果與分析
2.1 巖白菜素的制備
將用 2.00 kg 干燥的血三七獲得的除脂醇提液濃縮至 80 mL，加入 20 mL 甲醇搖勻，配制成 100 mL 溶液，將該溶液先用普通濾紙過濾，濾液再用 0.45 µm 的濾膜過濾，得到樣品的制備液。將樣品的制備液一次性吸入制備液相色譜柱，以乙腈 - 水為流動相梯度洗脫，運(yùn)行時間 60 min;0 min 時，乙腈含量為 5%， 60 min 時，乙腈含量為 60%;流速 20 mL/min，檢測波長 275 nm。按照峰收集洗脫液，濃縮各個峰的洗脫液，濃縮干后，用甲醇溶解，放置，結(jié)晶，過濾，得到小顆粒狀無色晶體，待晶體干燥后稱重 3.2 g。以分析液相色譜儀檢測該化合物純度為 98.5%(檢測條件：檢測波長 275 nm，流速 1 mL/min，洗脫液為乙腈 - 水，設(shè)定時間為 20 min，0 min 時，乙腈比例為 5%， 20 min 時，乙腈比例為 40%)，如圖 1 所示。
2.2 巖白菜素的鑒定
通過核磁測試得到該化合物的核磁共振氫譜圖，如 圖 2 所 示。 從 核 磁 共 振 氫 譜(1 H-NMR， CD3OD)可以看出，δ 7.07(1H, s, H-7)，δ 4.94(1H, d, J=12 Hz, H-10b)，4.07 (1H, d, J=8 Hz, H-4a)，4.03 (1H, d, J=8 Hz, H-11)，3.90(3H, s, -OCH3)，3.82 (1H, t, J=8 Hz, H-4)，3.70(1H, m, H-11)，3.66(1H, m, H-2)，3.44(1H, t, J=8 Hz, H-3)。通過核磁測試得到該化合物的核磁共振碳譜圖，如圖 3 所示。由核磁共振碳譜(13C-NMR，CD3OD)可以看出，該化合物有 14 個碳，其化學(xué)位移分別為 δ 164.3(C-6)， 150.9(C-8)，148.0(C-10)，140.8(C-9)，118.0(C-6a)， 115.8(C-10a)，109.6(C-7)，81.6(C-2)，79.9(C-4)， 74.2(C-4)，72.8(C-10)，70.4(C-3)，61.2(C-11)和 59.5(C-12)。綜合氫譜和碳譜數(shù)據(jù)可知該化合物與文獻(xiàn) [11] 報道的巖白菜素一致，故將該化合物鑒定為巖白菜素，其結(jié)構(gòu)如圖 4 所示。
2.3 巖白菜素的 DPPH 自由基清除試驗結(jié)果
巖白菜素和維生素 C 對 DPPH 自由基的清除率結(jié)果如圖 5 所示。從圖 5 可以看出，巖白菜素、維生素 C 對 DPPH 均具有很強(qiáng)的清除作用，化合物濃度越高清除率越大，巖白菜素的抗氧化能力強(qiáng)于陽性對照維生素 C。巖白菜素的體系終濃度 IC50 為 0.245 µg/mL，而維生素 C 的體系終濃度 IC50 為 0.575 µg/mL，從其 IC50 來看，巖白菜素的抗氧化活性強(qiáng)于比維生素 C。
巖白菜素的抗氧化活性強(qiáng)弱與化合物結(jié)構(gòu)中的酚羥基有關(guān)，其可能的抗氧化機(jī)理如圖 6 所示。
3 結(jié)論
文獻(xiàn)報道中華抱莖蓼的生理活性較多，其主要的活性物質(zhì)為蒽醌、綠原酸等化合物。而本文的實驗數(shù)據(jù)表明，中華抱莖蓼根中巖白菜素含量較高，該化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其清除 DPPH 自由基的體系終濃度 IC50 為 0.245 µg/mL，低于維生素 C 的體系終濃度(IC50 0.575 µg/mL)，說明巖白菜素的抗氧化活性高于維生素 C，預(yù)示了富含巖白菜素的中華抱莖蓼還具有抗氧化的新活性，同時巖白菜素的較強(qiáng)抗氧化活性表明其在食品天然抗氧化劑領(lǐng)域和醫(yī)藥保健行業(yè)具有潛在的應(yīng)用價值。
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