發(fā)布時間：2021-05-11所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:羥基酪醇是重要精細化學品，作為天然抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域。通過合成生物學技術(shù)開展微生物法生產(chǎn)羥基酪醇具有重要的研究意義。本文首先克隆并功能鑒定了來源于大腸桿菌EscherichiacoliBL21的羥化酶編碼基因HpaBC，結(jié)果表明該酶的兩個亞基
摘要:羥基酪醇是重要精細化學品，作為天然抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域。通過合成生物學技術(shù)開展微生物法生產(chǎn)羥基酪醇具有重要的研究意義。本文首先克隆并功能鑒定了來源于大腸桿菌EscherichiacoliBL21的羥化酶編碼基因HpaBC，結(jié)果表明該酶的兩個亞基均能成功表達并能催化酪醇生成羥基酪醇。通過CRISPR-Cas9技術(shù)將由tac啟動子調(diào)控的HpaBC基因表達盒整合到前期構(gòu)建的酪醇高產(chǎn)菌株YMG5A*R基因組中，同時刪除副產(chǎn)物乙酸的合成途徑，獲得大腸桿菌代謝工程菌株YMGRD1H1。搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果表明重組菌株能夠直接利用葡萄糖生產(chǎn)羥基酪醇，產(chǎn)量達到1.81g/L，同時發(fā)現(xiàn)幾乎沒有副產(chǎn)物積累。5L發(fā)酵罐規(guī)模的流加補料發(fā)酵實驗表明羥基酪醇最高產(chǎn)量達到2.95g/L，是目前文獻報道以葡萄糖從頭合成羥基酪醇的最高水平。通過系統(tǒng)改造大腸桿菌，實現(xiàn)了羥基酪醇的大量合成，為進一步構(gòu)建具有工業(yè)應(yīng)用潛力的羥基酪醇細胞工廠奠定了基礎(chǔ)，也為拓展芳香族化合物的微生物制造路線提供了有益的參考。
關(guān)鍵詞:大腸桿菌，羥化酶，酪醇，羥基酪醇，CRISPR-Cas9
羥基酪醇(Hydroxytyrosol，HT)也稱3,4-二羥基苯乙醇(3,4-DHPEA)，分子量為154.164，是一種天然的苯乙醇類化合物，具有非常高的抗氧化活性[1-2]。長期食用橄欖油益于人體健康，其主要功能成分為羥基酪醇[3-4]。目前，羥基酪醇可應(yīng)用于營養(yǎng)保健品、飼料、化妝品和制藥等多個行業(yè)，在食品防腐劑和添加劑等領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，羥基酪醇主要從制備橄欖油或其廢水中提取[1]，少量為化學合成，微生物生產(chǎn)羥基酪醇的市場占有率極低。鑒于天然提取原料的匱乏和化學合成嚴苛的反應(yīng)條件，利用微生物的細胞工廠安全高效地生產(chǎn)羥基酪醇成為必然趨勢。
如圖1所示，在微生物細胞內(nèi)以酪氨酸為底物引入不同的外源基因，可以構(gòu)建多種羥基酪醇合成途徑[1,5-7]。Chen等通過構(gòu)建途徑1和途徑2兩種混合途徑生產(chǎn)羥基酪醇;針對途徑3通過篩選高活性的酪氨酸羥化酶和胺氧化酶構(gòu)建出了高效的生產(chǎn)途徑，通過全細胞生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)的羥基酪醇產(chǎn)量最高為4.69g/L;同時針對途徑4構(gòu)建了酪氨酸和葡萄糖的雙途徑生產(chǎn)羥基酪醇，但其產(chǎn)量依舊較低。上述代謝途徑均對羥化酶等基因進行了分析及改造，或構(gòu)建混合酶體系的生產(chǎn)方式，對后續(xù)研究具有借鑒意義[7-8]。但上述途徑均主要以價格高昂的酪氨酸為底物，生產(chǎn)成本高;代謝途徑的構(gòu)建在質(zhì)粒基礎(chǔ)上進行，菌株的不穩(wěn)定性易造成質(zhì)粒的缺失;抗生素的使用為后期提取工藝及產(chǎn)品成分的限定造成阻礙，微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)羥基酪醇有待進一步的研究。
本研究在前期研究[9]的基礎(chǔ)上，將以葡萄糖為底物的酪醇高產(chǎn)菌株YMG5A*R作為出發(fā)菌株，進一步構(gòu)建羥基酪醇高產(chǎn)菌株。出發(fā)菌株YMG5A*R的主要代謝途徑如圖2所示，該菌株是以E.coliMG1655為宿主，在敲除相關(guān)分支途徑基因、調(diào)控阻遏基因等基礎(chǔ)上，整合表達5個拷貝的釀酒酵母菌株苯丙酮酸脫羧酶基因ARO10*。該重組菌能夠不需要添加抗生素及誘導(dǎo)劑條件下利用葡萄糖生產(chǎn)酪醇[10]。本文在高產(chǎn)酪醇基礎(chǔ)上，整合表達來源于E.coliBL21羥化酶基因HpaBC并進行乙酸副產(chǎn)物途徑改造，實現(xiàn)了代謝工程菌株高效生產(chǎn)羥基酪醇。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株及質(zhì)粒
YMG5A*R為本研究的出發(fā)菌株，研究中所用及構(gòu)建的菌株和質(zhì)粒如表1所示。
1.1.2引物設(shè)計
研究中所用引物如表2所示。
1.1.3試劑
研究中所用蛋白胨和酵母粉等試劑均購于賽默飛公司;無機鹽等試劑均購自國藥化學試劑有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海麥克林生化科技有限公司;葡萄糖、阿拉伯糖、壯觀霉素、硫酸卡那霉素等購自生工生物工程(上海)股份有限公司;酪醇、羥基酪醇等標準品均購自Sigma-Aldrich(中國上海);限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ等均購自賽默飛世爾科技公司;連接酶SolutionⅠ、PrimeSTAR®DNA聚合酶、ExTaq酶、rTaq酶等均購于寶生物工程(大連)有限公司。
1.1.4培養(yǎng)基及緩沖
液LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl10。固體LB培養(yǎng)基含有2.0%(W/V)瓊脂粉。滅菌條件為121℃、15min。
M9Y培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO4·12H2O17.1、KH2PO43、NaCl0.5、NH4Cl1、葡萄糖20、酵母粉0.25、5mmol/LMgSO4·7H2O。滅菌條件為115℃、15min。其中，MgSO4·7H2O母液需單獨滅菌，滅菌條件為121℃、15min。
PBS緩沖液(g/L)：NaCl8、KCl0.2、Na2PO41.42、KH2PO40.27。
1.2菌株構(gòu)建
1.2.1羥化酶基因HpaBC的獲取及重組質(zhì)粒構(gòu)建
以菌株E.coliBL21基因組為模板進行PCR獲得羥化酶基因HpaBC(GenBank登錄號：CP053601.1)，通過引物將兩個限制性酶切酶位點EcoRⅠ、HindⅢ分別引入基因兩端。
將pEtac質(zhì)粒和HpaBC基因用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ進行雙酶切后，用SolutionⅠ連接酶進行連接，轉(zhuǎn)入E.coliJM109感受態(tài)細胞中，篩選獲得JM109/pEtac-HpaBC菌株。
1.2.2重組菌株構(gòu)建
采用化學轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEtacHpaBC轉(zhuǎn)入酪醇高產(chǎn)菌株YMG5A*R中，獲得游離表達羥化酶的重組菌株YMG5A*R/pEtac-HpaBC。
相關(guān)期刊推薦：《生物工程學報》主要報道生物工程基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用研究的新成果、新技術(shù)、新進展，刊登研究報告、簡報和綜述，包括遺傳工程，細胞工程、發(fā)酵工程、酶工程、生化工程、代謝工程、組織工程、生物制藥、生物芯片及生物反應(yīng)器等方面的內(nèi)容。讀者對象為生物工程各領(lǐng)域的科研人員、大專院校師生、生產(chǎn)技術(shù)人員等。設(shè)有綜述、動物及獸醫(yī)生物技術(shù)、海洋生物技術(shù)、環(huán)境生物技術(shù)、工業(yè)生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、食品生物技術(shù)、系統(tǒng)生物技術(shù)、醫(yī)學與免疫生物技術(shù)、組織工程與細胞培養(yǎng)、生物技術(shù)與方法、科學進展/名家論壇等欄目。
采用CRISPR-Cas9技術(shù)[11]對出發(fā)菌株YMG5A*R基因組中產(chǎn)乙酸的關(guān)鍵基因poxB和ackA、pta[12]分別進行敲除。采用融合PCR的方法將poxB上下游同源臂進行連接，獲得poxB敲除盒，將其與質(zhì)粒pTargetF和pCas共同轉(zhuǎn)入菌株YMG5A*R中篩選獲得陽性克隆，消除質(zhì)粒后獲得poxB基因敲除的菌株YMGRD1。采用相同的方法構(gòu)建ackA-pta基因敲除的菌株YMGRD2。采用上述方法獲得tac-HpaBC基因整合表達盒，將其與質(zhì)粒pCas和pTargetF共同轉(zhuǎn)入菌株YMG5A*R中，篩選獲得陽性克隆YMGRD1H1。
1.3搖瓶發(fā)酵條件
將保藏的菌種在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于裝有20mLLB液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶中，于37℃、200r/min培養(yǎng)過夜。按1%接種量，轉(zhuǎn)接含有50mLLB液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于37℃、200r/min培養(yǎng)10h后收集菌體。將其用無菌水洗一次，轉(zhuǎn)接至裝有50mLM9Y液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于30℃、200r/min培養(yǎng)48h。每隔12h取樣檢測OD600和產(chǎn)物含量。其中，游離表達羥化酶時，菌體濃度OD600達到0.5時加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。培養(yǎng)基中所需抗生素主要包括：卡那霉素(50mg/L)和壯觀霉素(100mg/L)。
1.4SDS-PAGE電泳條件
將YMG5A*R/pEtac-HpaBC菌株在LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后，6000r/min離心10min，收集菌體。將菌體水洗一次后，用25mLPBS緩沖液重懸，破壁后離心取上清及沉淀，分別進行SDS-PAGE電泳驗證。
1.5發(fā)酵罐發(fā)酵條件
將菌株活化培養(yǎng)，以1%接種量接種到裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于37℃、200r/min培養(yǎng)至OD600為1.5–2.0時，按照10%的接種量接種于裝有2LM9Y培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中。
發(fā)酵過程通氣比恒定為1.5vvm，逐漸增加攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵液DO值30%–40%至最高轉(zhuǎn)速600r/min;流加200g/L酵母粉母液(8mL/次)補充菌株生長所需養(yǎng)分促進菌株生長，繼續(xù)維持溶氧濃度。采用兩階段控溫發(fā)酵，0–14h為37℃，14–48h為30℃。發(fā)酵過程中，通過流加氨水自動控制發(fā)酵液pH=7.0。每間隔4h取樣檢測OD600、葡萄糖、酪醇和羥基酪醇產(chǎn)量。根據(jù)檢測結(jié)果，控制流加葡萄糖至終濃度維持在5g/L。
1.6檢測方法
1.6.1酪醇、羥基酪醇檢測方法
將發(fā)酵液沸水浴15min，離心收集上清，并采用微孔濾膜過濾。高效液相色譜(HPLC)分析條件如下：流速1mL/min;流動相為80%(V/V)的甲酸(0.1%，W/V)和20%(V/V)的純甲醇;博納艾杰爾C18柱(4.6mm×250mm，5μm);柱溫28℃;波長為280nm;紫外檢測器;進樣量為10μL。
1.6.2有機酸檢測方法樣品處理同1.6.1方法。HPLC分析條件如下：流速0.5mL/min;流動相為5mmol/L稀硫酸;博納艾杰爾有機酸分析柱(7.8mm×300mm，9μm);柱溫55℃;RID示差法檢測器;進樣量為10μL。
1.6.3葡萄糖檢測方法葡萄糖采用生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所)進行檢測。
2結(jié)果與分析
2.1羥化酶HpaBC的表達
采用質(zhì)粒pEtac表達羥化酶HpaBC，將構(gòu)建的重組菌YMG5A*R/pEtac-HpaBC進行誘導(dǎo)培養(yǎng)并SDS-PAGE電泳分析。如圖3所示，重組菌的全細胞電泳(泳道3)和細胞沉淀部分(泳道5)均有兩條顯著的蛋白電泳條帶，其大小分別在58kDa和19kDa左右，與4-羥基苯乙酸3-單加氧酶(HpaB)和黃素還原酶(HpaC)的理論分子量一致，表明HpaBC成功表達。由泳道4可以看出，在細胞破碎液的上清部分中，僅有明顯的HpaB蛋白條帶，表明HpaC基因表達產(chǎn)物多為包涵體。
2.2羥化酶HpaBC活性驗證
研究中進一步驗證了HpaBC基因表達產(chǎn)物是否具有催化生產(chǎn)羥化酪醇的活性。如圖4所示，重組菌株YMG5A*R/pEtac-HpaBC發(fā)酵48h，羥基酪醇產(chǎn)量達0.15g/L。但對照菌株YMG5A*R發(fā)酵液中未檢測到羥基酪醇積累，證明表達的HpaBC酶具有催化活性。但游離表達HpaBC酶時，重組菌的羥基酪醇產(chǎn)量較低，需要進一步改造提升羥基酪醇產(chǎn)量。
2.3乙酸合成途徑敲除
在羥基酪醇發(fā)酵生產(chǎn)過程中，重組菌株YMG5A*R/pEtac-HpaBC存在乙酸積累和pH降低等現(xiàn)象。大腸桿菌中的乙酸途徑主要包括兩個：①丙酮酸經(jīng)poxB基因表達的丙酮酸氧化酶轉(zhuǎn)化為乙酸;②乙酰輔酶A經(jīng)ackA、pta基因表達的乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶轉(zhuǎn)化為乙酸。分別敲除菌株YMG5A*R中基因poxB、ackA-pta，構(gòu)建了重組菌株YMGRD1和YMGRD2并考察乙酸合成水平。——論文作者：劉春筱1,2，夏媛媛1,2，齊麗娜1,2，楊海泉1,2，陳磊1,2，沈微1,2，陳獻忠1,2
