發(fā)布時間：2022-03-21所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)在生物制劑領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的方法有微載體培養(yǎng)、片狀載體培養(yǎng)和全懸浮培養(yǎng)等，與傳統(tǒng)的動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝相比有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。本文主要分析了動物細胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技
摘 要：生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)在生物制劑領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的方法有微載體培養(yǎng)、片狀載體培養(yǎng)和全懸浮培養(yǎng)等，與傳統(tǒng)的動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝相比有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。本文主要分析了動物細胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的研究進展，以供參考。
關(guān)鍵詞：生物反應(yīng)器;微載體;片狀載體;全懸浮培養(yǎng)
動 物 細 胞 的 大 規(guī) 模 培 養(yǎng)(large-scale culture)是通過使用生物反應(yīng)器在精確控制溫度、溶氧、pH 等條件下實現(xiàn)的 [1]，該技術(shù)在生物制劑的生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)的產(chǎn)品包括蛋白質(zhì)藥物、單克隆抗體、病毒疫苗等。近幾十年來，動物細胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)有了很大的發(fā)展，在傳統(tǒng)的生物反應(yīng)器的設(shè)計上做了很多重要的改進，并且開發(fā)了多種新型的生物反應(yīng)器，例如：多功能膜生物反應(yīng)器、Couette-Taylor 生物反應(yīng)器等。生物反應(yīng)器所需達到的兩個最主要的目標，一是通過高密度培養(yǎng)動物細胞增加產(chǎn)量，生產(chǎn)高價值的蛋白質(zhì)藥劑或臨床病毒載體 ;二是創(chuàng)造一個類似于體內(nèi)環(huán)境的三維空間來增殖傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)中難以培養(yǎng)的有價值細胞。動物細胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)常用的方法有微載體培養(yǎng)、片狀載體培養(yǎng)和全懸浮培養(yǎng)，其技術(shù)的主要進展情況綜述如下。
1 微載體培養(yǎng)
微載體培養(yǎng)是融合懸浮培養(yǎng)優(yōu)點的一種特殊的細胞貼壁培養(yǎng)模式。細胞微載體培養(yǎng)的基本特征是細胞貼附于微載體的表面并隨微載體懸浮于細胞培養(yǎng)液中。隨著生產(chǎn)需求的增長，微載體培養(yǎng)細胞很容易放大，多孔微載體是一種新型的微載體，細胞可以生長在其表面和內(nèi)部，這在很大程度上增大了細胞的生長面積。適合微載體大規(guī)模培養(yǎng)的細胞有 Vero、BHK21、 MDCK、Marc-145、PK15等。
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以交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)材料的實體微載體- Cytodex-1和 Cytodex-3是 Vero 細胞培養(yǎng)中使用最多的微載體。Cytodex-3是由變性膠原包被交聯(lián)葡聚糖基質(zhì)構(gòu)成的，1 g Cytodex-3提供的表面積約為 2 700 cm2 ，細胞總量可達 4.6×108 個，且對細胞具有良好的相容性。Cytodex-1交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)時，表面包裹有帶正電荷的 N，N二乙基氨基乙基(DEAE)基團使細胞更適合于細胞貼附生長。1 g Cytodex-1細胞生長面積約為 4 400 cm2 ，細胞總量可達 6×108 個。1967年出現(xiàn)了微載體細胞培養(yǎng)，20世紀 80年代巴斯德研究所用1 000 L 規(guī)模的生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng) Vero 細胞生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎疫苗和人用狂犬病疫苗，目前巴斯德研究用微載體培養(yǎng)的 Vero 細胞在攪拌式生物反應(yīng)器中生產(chǎn)流感疫苗，其細胞培養(yǎng)工藝在8個周內(nèi)就可以將復(fù)蘇的細胞放大到 6 000 L 的規(guī)模 [2]。攪拌式生物反應(yīng)器通過灌注培養(yǎng)技術(shù)利用微載體或多空載體細胞密度最終可以達 107 個 /ml 以上。
2 片狀載體培養(yǎng)
片狀載體是無紡聚酯纖維片，屬于一種細胞貼壁載體，具有很大的比表面積 (1 200 cm2 .g-1)，可以多次使用。自 20世紀 90年代中期美國的 NBS 公司推出片狀載體 (FibraCel) 和固定藍式攪拌系統(tǒng)以來，相關(guān)的產(chǎn)品設(shè)備已廣泛應(yīng)用于基因藥物治療、病毒性疫苗和細胞分泌物等生物制品及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的實際生產(chǎn)中。
固定床式生物反應(yīng)器用片狀載體大規(guī)模培養(yǎng) 293T 細胞增殖慢病毒的工藝中，在1.5 L 反應(yīng)器中加入 50 g 片狀載體，按 8.0×105 個 /mL 接種，當細胞培養(yǎng)3 d 時，細胞密度達1×107 ～ 1.5×107 個 /mL[3]。用14 L 籃式生物反應(yīng)器培養(yǎng) Vero 細胞生產(chǎn)人用狂犬病疫苗時(片狀載體500 g)，按10 L 培養(yǎng)液接種5.0×109 個 Vero 細胞，灌流培養(yǎng)使培養(yǎng)液中葡萄糖含量保持在1.0 g/L 以上，直至細胞生長進入平臺期，葡萄糖消耗量為240 ～ 420 g，細胞接種96 h 后達對數(shù)生長期，根據(jù)消耗的葡萄糖量計算細胞總數(shù) , 培養(yǎng)156 h 后細胞密度可達 1.0×107 個 /ml[4]。
3 全懸浮培養(yǎng)
細胞懸浮培養(yǎng)是利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)生物制品的核心技術(shù)，是目前國際上生物制品生產(chǎn)的主流模式。動物疫苗生產(chǎn)的核心環(huán)節(jié)就是病毒抗原的生產(chǎn)制造，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶或雞胚工藝生產(chǎn)效率低、勞動強度大、批間差異大，這些先天的缺點導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量差，成本居高不下，已經(jīng)不能滿足規(guī)模化養(yǎng)殖客戶的需求。生物反應(yīng)器以其規(guī)模大、生產(chǎn)效率高、產(chǎn)品批間差異小的優(yōu)勢在口蹄疫行業(yè)一經(jīng)應(yīng)用便迅速得到推廣，目前口蹄疫疫苗行業(yè)已經(jīng)全部實現(xiàn)了生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。禽流感、狂犬、圓環(huán)等越來越多的疫苗品種正在試圖采用懸浮培養(yǎng)技術(shù)，它已經(jīng)成為了企業(yè)轉(zhuǎn)型升級的一把利器。
生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng) BHK21細胞生產(chǎn)口蹄疫病毒是口蹄疫疫苗生產(chǎn)最普遍的方式 [5]。印度生產(chǎn)口蹄疫疫苗使用8 000 L 的生物反應(yīng)器，中國和南美用3 000 ～ 5 000 L 的生物反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗。2009年，默克密理博和北京清大天一科技有限公司開發(fā)了 BHK21無血清培養(yǎng)基。 2010年蘭州百靈公司和宜興賽爾公司開發(fā)了適合口蹄疫疫苗生產(chǎn)的無血清培養(yǎng)基，使合作企業(yè)取得了無血清懸浮培養(yǎng) BHK21細胞的口蹄疫疫苗生產(chǎn)批文。中空纖維生物反應(yīng)器主要用于動物細胞無血清懸浮培養(yǎng)，這種生物反應(yīng)器的主要優(yōu)勢在于營養(yǎng)不間斷供應(yīng)，從而防止代謝物的積累，在這樣的條件下培養(yǎng)細胞密度可達 109 /ml，因此中空纖維生物反應(yīng)器應(yīng)用很廣泛。
4 結(jié)語
貼壁培養(yǎng)型細胞可采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、片狀載體籃式培養(yǎng)等，其中籃式培養(yǎng)操作簡單易控，可培養(yǎng)高密度生長的細胞，一般情況下，微載體培養(yǎng)細胞可擴增 10倍 [6，7]，而籃式培養(yǎng)可達 20倍左右 [8，9]。片狀載體可吸附脫落的細胞和宿主蛋白，易得到高質(zhì)量的收獲液 [10]，缺點是難以放大，目前國內(nèi)各企業(yè)均采用罐群進行規(guī)模化生產(chǎn)。懸浮培養(yǎng)是細胞大規(guī)模培養(yǎng)的努力方向，但是細胞馴化和個性化培養(yǎng)基設(shè)計和優(yōu)化技術(shù)難度較大。
動物細胞生物反應(yīng)器大規(guī)模微載體培養(yǎng)時，有很多因素影響動物細胞的高密度增殖，包括 pH、溫度、溶解氧、營養(yǎng)素消耗、代謝物積累、血清、生長因子、細胞外基質(zhì)、剪應(yīng)力和細胞凋亡等。生物反應(yīng)器通常具有探針或傳感器自動檢測活細胞的生長環(huán)境，對上述限制性因素實行計算機自動控制，包括通氣量、攪拌速度、懸浮均勻程度、pH 穩(wěn)定性、溫度變化、罐壓、培養(yǎng)體積及溶氧供應(yīng)等參數(shù)。細胞的培養(yǎng)環(huán)境直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和數(shù)量，因此生物反應(yīng)器的在線控制發(fā)揮著很重要的作用。——論文作者：阿爾祖古麗·阿依丁1 ，阿依木古麗1 ，喬自林1 ，馬桂蘭2*
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