發(fā)布時間：2019-12-05所屬分類：園林工程師瀏覽：1次
摘 要： 摘要:本研究旨在利用金標(biāo)銀染顯色技術(shù)，構(gòu)建同時檢測禽白血病病毒(ALV)、雞馬立克病病毒(MDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的可視化基因芯片。利用T-A法分別克隆得到ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2
摘要:本研究旨在利用金標(biāo)銀染顯色技術(shù)，構(gòu)建同時檢測禽白血病病毒(ALV)、雞馬立克病病毒(MDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的可視化基因芯片。利用T-A法分別克隆得到ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2基因，并利用本實(shí)驗(yàn)室已保存的AIV-np、NDV-f、ILTV-tk基因序列，設(shè)計寡核苷酸探針，制備ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV基因芯片陣列。引入生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并與芯片進(jìn)行雜交銀染顯色，肉眼觀察檢測結(jié)果，并對芯片的特異性、敏感性、穩(wěn)定性進(jìn)行評價，以及臨床初步驗(yàn)證。成功克隆ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp2共3個靶基因，測序鑒定其正確性。發(fā)現(xiàn)寡核苷酸探針最優(yōu)使用濃度為50μmol·L-1，40℃條件下雜交2h，Nanogold-Streptavidin鏈霉親和素溶液的質(zhì)量濃度為4μg·mL-1，銀染5min，可見明顯的檢測信號。特異性試驗(yàn)顯示，ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之間無交叉反應(yīng)，且以雞傳染性支氣管炎病毒為模板制備的PCR擴(kuò)增標(biāo)記不與ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV芯片雜交。芯片檢測的靈敏度為1pg·μL-1。芯片在常溫條件下保存60d，在4℃條件下保存75d仍可進(jìn)行有效檢測。臨床病料檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果一致。本研究成功構(gòu)建同時檢測ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV的金標(biāo)銀染可視化基因芯片，并確定其最佳反應(yīng)條件，為臨床標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞:家禽;病毒檢測;可視化芯片;金標(biāo)銀染
隨著我國家禽養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)模程度的提高，家禽呼吸和免疫抑制類疾病的發(fā)病率逐漸上升。禽流感病毒(avianinfluenzavirus，AIV)、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus，ILTV)是引發(fā)家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。傳染性法氏囊病毒(infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)、雞馬立克病病毒(Marek’sdiseasevirus，MDV)、禽白血病病毒(avianleukosisvirus，ALV)是引發(fā)家禽免疫抑制病的主要病毒性病原，臨床癥狀相似，難以鑒別診斷，并表現(xiàn)出從單一的病原感染向多種病原混合感染方向發(fā)展的趨勢。如J亞群ALV的env基因的可變區(qū)不斷地發(fā)生變化，導(dǎo)致該病毒的抗原性不斷地進(jìn)化和改變[1-2]。2013年，新的AIV亞型H7N9被發(fā)現(xiàn)[3-4]。新出現(xiàn)的毒株，給家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重威脅著人類的健康。
基因芯片是繼PCR后發(fā)展起來的一項(xiàng)具有快速、特異性好、敏感性強(qiáng)及高通量等優(yōu)點(diǎn)的自動化基因檢測技術(shù)，已被廣泛地應(yīng)用于藥物開發(fā)、基因突變、基因表達(dá)等方面[5]。目前基因芯片在禽類病毒檢測方面的應(yīng)用大多是基于熒光掃描的基因芯片技術(shù)或酶與底物可視化顯色技術(shù)[3，6-9]。然而熒光掃描比較昂貴，酶和底物顯色所使用的尼龍膜或者纖維素性薄膜芯片不易保存，這極大地限制了芯片診斷在臨床診斷中的應(yīng)用。近年來，關(guān)于金標(biāo)銀染可視化顯色技術(shù)與基因芯片相結(jié)合的文獻(xiàn)報道呈遞增趨勢[10-11]，因其檢測結(jié)果可脫離昂貴的傳統(tǒng)熒光掃描儀，且操作簡單，高靈敏性等特點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于基因突變分析、疾病診斷、藥物篩選等方面[12-14]，因此越來越廣泛地被人們用于疾病的檢測[2]。
考慮到家禽疫病防控急需，且目前尚未見ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV六種病毒金標(biāo)銀染可視化基因芯片的報道。因此，本研究以ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV以及ILTV為研究對象，通過金標(biāo)銀染顯色，構(gòu)建了一套能夠同時檢測這六種禽類病毒的可視化基因芯片檢測技術(shù)，為家禽呼吸道和免疫抑制病的臨床標(biāo)準(zhǔn)化診斷應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，從而保障我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。
1材料與方法
1.1生物材料
靶基因重組質(zhì)粒T/AIV-np、T/DNV-f、T/ILTVtk、λ定位基因重組質(zhì)粒，大腸桿菌DH5α由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心構(gòu)建并保存。MDV和IBDV組織液由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院黃勇教授提供。ALV的DNA核酸由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授提供。臨床病料采自四川安岳、大邑、彭州、蒲江等地區(qū)疑似禽白血病、馬立克病、雞傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫和雞傳染性喉氣管炎患病雞的喉氣管、肺、脾、肝、腎及法氏囊組織。
1.2主要試劑
總RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、普通DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;PrimeScriptRTReagentKit購自寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司;晶芯芯片點(diǎn)樣液、晶芯光學(xué)級醛基基片、晶芯12樣品芯片圍欄購自北京博奧生物有限公司;金標(biāo)鏈霉親和素Nanogold-Streptavidin購自美國Nanoprobes公司;銀染試劑SilverbufferA、SilverbufferB購自美國Sigma公司;封閉液按照0.5%BH4Na，25%Ethanol，0.75×PBS比例配制。
1.3主要儀器
晶芯SmartArrayerTM16，微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)CapitalbioCorporation購自北京博奧生物公司;分子雜交儀購自美國Thermo公司;芯片雜交盒及雜交相關(guān)產(chǎn)品購自北京Capitalbio生物有限公司;高純氮?dú)馄抠徸运拇ü诜鍤怏w有限公司。
1.4ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2基因的克隆鑒定
λ定位基因的引物參考曹三杰[15]設(shè)計合成。利用DNAStar軟件的Megalign對NCBI收錄的ALV、MDV、IBDV毒株的基因序列進(jìn)行比對分析，以Primer5.0設(shè)計3對引物(ALV的env基因，MDV的meq基因，IBDV的vp2基因)，靶基因擴(kuò)增長度在200～800bp之間，Tm為(55±5)℃，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成(表1)，用生物素對靶基因下游引物的5'端進(jìn)行修飾。
提取IBDV毒株的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，提取ALV、MDV的DNA，以cDNA/DNA為模板擴(kuò)增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，切膠回收產(chǎn)物連接pMD19-TSimple載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后陽性的重組質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序后保存?zhèn)溆谩ＨLVenv、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f、ILTV-tk和λ菌落分別進(jìn)行菌液PCR，用生物素對靶基因下游引物的5'端進(jìn)行修飾。
1.5探針設(shè)計與芯片制備
針對每個靶基因序列片段，各選取一條單鏈核酸序列作為寡核苷酸探針，確保各探針的Tm值為75℃±5℃，長度為45bp左右，并在每條寡核苷酸探針的5'端添加15個T堿基作為連接臂，同時進(jìn)行氨基化修飾。探針由上海生物工程有限公司合成(表2)。
將點(diǎn)樣緩沖液和ddH2O按1∶4的比例混勻，用以稀釋合成的寡核苷酸探針，調(diào)整其終濃度為50μmol·L-1，按照設(shè)計好的檢測陣列排布進(jìn)行非接觸噴樣方式噴樣(圖1)。噴樣結(jié)束后，紫外交聯(lián)5min，芯片置于濕盒內(nèi)，37℃水合過夜。隨后，在37℃條件下，封閉液封閉30min。取出芯片，超純水清洗5次。自然干燥，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.6可視化基因芯片的檢測
用生物素標(biāo)記的引物分別擴(kuò)增ALV-env、MDVmeq、IBDV-vp2、NDV-f、AIV-np和ILTV-tk六種靶基因，并將其PCR產(chǎn)物等量混勻，于100℃水浴變性5min，立即冰浴3min，防止DNA雙鏈復(fù)性。隨后將PCR產(chǎn)物混合液加入含圍欄固定的芯片陣列區(qū)域，40℃條件下雜交120min，雜交結(jié)束后，超純水洗凈后自然干燥。將質(zhì)量濃度為4μg·mL-1的NanogoldStreptavidin的鏈霉親和素溶液緩慢加入到芯片對應(yīng)的陣列區(qū)域，37℃孵育30min。超純水洗凈后自然干燥。避光條件下，將銀染試劑中的SilverbufferA和SilverbufferB等體積混勻，取200μL混合液加入芯片陣列區(qū)域，觀察并記錄芯片上可視化信號出現(xiàn)的時間。當(dāng)可視化芯片陽性對照相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯的雜交信號，而陰性對照相應(yīng)位置無明顯的雜交信號時，清洗芯片，終止顯色。眼觀可視化芯片結(jié)果，在芯片相應(yīng)位置若出現(xiàn)明顯黑色銀染信號，即判定為雜交陽性，反之則判定為雜交陰性。
1.7可視化基因芯片的質(zhì)量評價
1.7.1特異性試驗(yàn)ALV-env、MDV-meq、IBDVvp2、AIV-np、NDV-f和ILTV-tk的單鏈靶基因，單獨(dú)與芯片進(jìn)行雜交顯色，眼觀雜交結(jié)果。
1.7.2敏感性試驗(yàn)使用ddH2O將提取的靶基因質(zhì)粒(初始質(zhì)量濃度為1ng·μL-1)依次進(jìn)行101～105倍稀釋，PCR擴(kuò)增標(biāo)記，擴(kuò)增產(chǎn)物混勻后與芯片進(jìn)行雜交顯色，眼觀雜交結(jié)果。
1.7.3穩(wěn)定性試驗(yàn)將同一批生產(chǎn)的芯片，分別放置在常溫和4℃條件下密封保存。分別在30、60、75、90d隨機(jī)抽出一張芯片，按照“1.6”步驟，與生物素標(biāo)記的靶基因進(jìn)行雜交，銀染顯色眼觀結(jié)果，以評價芯片的穩(wěn)定性。
以上特異性、敏感性及穩(wěn)定性試驗(yàn)均重復(fù)三次。
1.8臨床樣品的初步驗(yàn)證
將收集的51份疑似患禽免疫抑制性和呼吸道疾病的青腳麻雞、白羽肉雞和烏雞的喉氣管、肺、腎、脾、肝、法氏囊組織，混合研磨勻漿后，滅菌的PBS勻漿稀釋，-70℃條件下反復(fù)凍融三次，4℃，12000r·min-1離心10min，取上清500μL進(jìn)行RNA和DNA的提取。提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別用臨床樣品的PCR技術(shù)和基因芯片同時進(jìn)行檢測，對比兩者檢測結(jié)果。
期刊推薦：《畜牧獸醫(yī)學(xué)報》本學(xué)報是中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會主辦，創(chuàng)刊于1956年7月，刊登較高水平的學(xué)術(shù)論文和企業(yè)研究報告以及對生產(chǎn)實(shí)踐具指導(dǎo)性、啟發(fā)性的文章。為全國中文核心期刊、中國自然科學(xué)核心期刊，并被國內(nèi)外重要引文數(shù)據(jù)庫及文摘性期刊收錄。
2結(jié)果
2.1靶基因的擴(kuò)增、克隆及重組質(zhì)粒菌復(fù)蘇鑒定
成功擴(kuò)增ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp2靶基因片段，測序結(jié)果顯示，與NCBI中收錄的同一病毒的不同毒株靶基因序列具有99%以上的相似性(表3)。對ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDVf、ILTV-tk進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖2)，PCR擴(kuò)增的目的片段與預(yù)期大小一致。
2.2基因芯片制備的初檢
2.2.1陽性定位基因的檢測以λDNA定位基因?yàn)槟０暹M(jìn)行靶基因擴(kuò)增標(biāo)記，將λDNA擴(kuò)增產(chǎn)物與含6種病毒探針的芯片進(jìn)行雜交，銀染顯色，肉眼觀察試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示陽性質(zhì)控λDNA定位基因雜交斑點(diǎn)明顯可見，陰性對照和其他探針斑點(diǎn)沒有可見雜交斑點(diǎn)(圖3)。表明本研究制備的醛基基片及陽性定位基因質(zhì)量可靠。
2.2.2共檢芯片全基因的檢測6種病毒6個探針基因的全部探針位點(diǎn)均可以看到明顯的雜交斑點(diǎn)，陽性對照斑點(diǎn)明顯，陰性對照沒有可見雜交斑點(diǎn)，表明制備的可視化共檢芯片、選用探針基因質(zhì)量可靠(圖4)。
2.3可視化基因芯片的質(zhì)量評價
2.3.1特異性試驗(yàn)評價ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f和ILTV-tk單獨(dú)與可視化芯片雜交時只在芯片的相應(yīng)位置出現(xiàn)了肉眼可見的雜交斑點(diǎn)，且各個探針之間無非特異性雜交的情況。使用IBV-n基因擴(kuò)增產(chǎn)物與可視化芯片雜交后，芯片的相應(yīng)位置無肉眼可見雜交信號斑點(diǎn)，雜交結(jié)果呈陰性(圖5)。說明本試驗(yàn)構(gòu)建的基因芯片具有高的特異性。
