發(fā)布時(shí)間：2021-05-18所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種革蘭氏陰性致病菌，引發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物以及人類的多種疾病，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及人類公共健康造成嚴(yán)重威脅，但其致病機(jī)制尚不明確。維氏氣單胞菌C4菌株基因組分析發(fā)現(xiàn)，與細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)有關(guān)的鞭毛合成基因fliE相鄰位置存
摘要維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種革蘭氏陰性致病菌，引發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物以及人類的多種疾病，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及人類公共健康造成嚴(yán)重威脅，但其致病機(jī)制尚不明確。維氏氣單胞菌C4菌株基因組分析發(fā)現(xiàn)，與細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)有關(guān)的鞭毛合成基因fliE相鄰位置存在一個(gè)功能未知的AraC家族轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，我們將其命名為asfR。NCBICD-Search預(yù)測(cè)結(jié)果顯示AsfR蛋白含有一個(gè)保守的HTHDNA結(jié)合功能域，以及一個(gè)類似GyrI的小分子結(jié)合功能域。已知AraC蛋白超家族廣泛存在于細(xì)菌中，參與從碳代謝、應(yīng)激反應(yīng)，到細(xì)菌毒力和致病性的多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。asfR基因在維氏氣單胞菌AVNIH1和TH0426菌株中高度保守，但對(duì)其生物學(xué)功能的研究尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步探究該蛋白的功能，本研究采用同源重組手段構(gòu)建asfR基因敲除菌株，并與野生型菌株進(jìn)行初步比較，發(fā)現(xiàn)asfR基因敲除不影響致病菌在富營(yíng)養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)能力，但能顯著提高其在逆境下的生長(zhǎng)能力，而且其生物膜形成能力減弱。上述結(jié)果表明，AsfR參與維氏氣單胞菌生物膜形成以及逆境抵抗。本研究為進(jìn)一步鑒定該蛋白的生物學(xué)功能提供了必要的研究工具和初步的理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞維氏氣單胞菌,asfR,基因敲除,生長(zhǎng),生物膜
維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一類造成嚴(yán)重危害的革蘭氏陰性致病菌，引起魚體爛尾病、敗血癥等(Malliketal.,2020;Ranetal.,2018)，還能引發(fā)人類腹瀉、腦膜炎、壞死性筋膜炎等疾病(Predigeretal.,2020;Parrasetal.,1993;Cuietal.,2007)。維氏氣單胞菌能分泌多種與其致病性密切相關(guān)的胞外產(chǎn)物，包括氣溶素、溶血素、腸毒素、蛋白酶等(Huetal.,2012;Ranetal.,2018)。已知細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SS是革蘭氏陰性致病菌的關(guān)鍵毒力因子，其發(fā)揮分子注射器的功能，將大量效應(yīng)物注射到宿主細(xì)胞的胞漿中，進(jìn)而影響宿主的細(xì)胞代謝通路(GalánandWolf-Watz,2006)。新近研究表明，細(xì)菌的鞭毛活性，通過(guò)影響其在感染部位的運(yùn)動(dòng)能力，進(jìn)而間接調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)功能(Hirakawaetal.,2020)。另外，在面臨宿主以及自然環(huán)境中的惡劣條件時(shí)，致病菌通常以形成生物膜的方式提高種群生存率,包裹在生物膜內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞對(duì)宿主體內(nèi)的免疫細(xì)胞、抗體和抗生素等具有抵抗力，使得宿主防御系統(tǒng)和抗菌藥物無(wú)法清除生物膜內(nèi)的細(xì)菌病原體(Royetal.,2018,Diasetal.,2018)。深入探究A.veronii的致病機(jī)制，將為預(yù)防與治療該致病菌導(dǎo)致的動(dòng)物和人類疾病、減輕其所造成的經(jīng)濟(jì)損失提供理論依據(jù)。
我們前期對(duì)維氏氣單胞菌C4的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在與Ⅲ型分泌系統(tǒng)有關(guān)的鞭毛合成基因fliE的相鄰位置處，存在一個(gè)功能未知的基因，其被注釋為AraC超家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(AraCfamilytranscriptionalregulator)編碼基因，我們將其命名為asfR(AraCSuperfamilyregulator)。通過(guò)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因在維氏氣單胞菌的強(qiáng)毒株系A(chǔ)VNIH1和TH0426中高度保守，同源性達(dá)98%。NCBICD-Search預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，AsfR蛋白含有一個(gè)保守的AraC家族HTHDNA結(jié)合功能域，以及一個(gè)類似GyrI的小分子結(jié)合功能域。已知AraC轉(zhuǎn)錄因子蛋白超家族廣泛參與革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌的碳代謝、應(yīng)激反應(yīng)、毒力以及耐藥性等多種生命進(jìn)程(Yangetal.,2011;Pletzeretal.,2014;Santiagoetal.,2016;Gallegosetal.,1997)。在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，一個(gè)假定AraC家族轉(zhuǎn)錄因子基因鄰近膽固醇降解相關(guān)的芳胺N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(nat)基因，其被鑒定能激活nat基因簇(Evangelopoulosetal.,2014)。為了探明AsfR的生物學(xué)功能，本研究采用同源重組基因敲除技術(shù)，構(gòu)建了asfR基因敲除菌株，并與維氏氣單胞菌野生型進(jìn)行比較，初步測(cè)定敲除株的生長(zhǎng)能力和生物膜形成能力。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步研究AsfR蛋白在維氏氣單胞菌致病性調(diào)控方面的功能提供了必要的研究工具，并奠定了初步的研究基礎(chǔ)。
1結(jié)果與分析
1.1基因敲除載體的構(gòu)建
以A.veroniiC4的基因組為模板，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)分別擴(kuò)增asfR基因上下游同源臂，基于同源重組原理對(duì)A.veroniiC4asfR基因進(jìn)行敲除(圖1)。擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，參照DNAMarker條帶大小，asfR上/下游同源臂片段分別為500bp和750bp左右，與實(shí)際asfR上/下游同源臂片段大小536bp和705bp相符。采用重疊延伸PCR技術(shù)(genesplicingbyoverlapextensionPCR)連接asfR上下游同源臂，獲得融合產(chǎn)物1300bp左右(圖2)。PCR產(chǎn)物條帶單一、無(wú)污染，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
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采用無(wú)縫克隆技術(shù)連接asfR同源臂和pRE112質(zhì)粒(圖3)。將pRE112質(zhì)粒酶切后，與asfR同源臂按摩爾比1:2的體系混合，在重組酶的作用下于50℃連接5分鐘。將連接產(chǎn)物以電擊轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入至E.coliWM3064中，并涂布于含有50μg/mLDAP(二氨基庚二酸)和25μg/mLCam(氯霉素)的LB板上進(jìn)行篩選，其中，DAP為E.coliWM3064的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，Cam用于篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。隨后，通過(guò)pRE112載體特異性引物以及目的基因驗(yàn)證引物(表1)驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。圖4顯示通過(guò)pRE112載體特異性引物驗(yàn)證的結(jié)果，泳道2陽(yáng)性對(duì)照的模板為pRE112質(zhì)粒，擴(kuò)增條帶大小約600bp;泳道5、7、8、9以轉(zhuǎn)化子菌液為模板，獲得PCR產(chǎn)物為1900bp左右，與理論值相符。泳道3的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)物大小有偏差，泳道6的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生兩條產(chǎn)物帶，因而將其舍棄。圖5顯示進(jìn)一步通過(guò)目的基因驗(yàn)證引物驗(yàn)證的結(jié)果，泳道2的陽(yáng)性對(duì)照為以A.veroniiC4基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，條帶大小為2000bp左右;泳道5、7、8、9以轉(zhuǎn)化子菌液為模板，獲得PCR產(chǎn)物為1500bp左右，與理論值相符。將檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析進(jìn)一步證實(shí)asfR基因敲除載體pRE112-ΔasfR構(gòu)建成功。
1.2細(xì)菌接合
通過(guò)細(xì)菌接合的方式將E.coliW3064菌中的asfR敲除載體pRE112-ΔasfR轉(zhuǎn)移至維氏氣單胞菌C4中，通過(guò)25μg/mLCam和50μg/mLAmp的雙抗平板篩選獲得敲除載體的受體克隆子。采用pRE112載體特異引物，通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子。驗(yàn)證結(jié)果如圖6所示，泳道2-9中的PCR產(chǎn)物條帶大約為1900bp左右，與理論結(jié)果相符，表明pRE112-ΔasfR載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)移至A.veroniiC4中(圖6)。
1.3蔗糖板篩選asfR基因敲除菌株
挑取平板單菌落，將含有pRE112-ΔasfR載體的維氏氣單胞菌C4于LB中過(guò)夜培養(yǎng)后，然后涂布于含有8%蔗糖的平板上進(jìn)行篩選，菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子。以A.veroniiC4野生型基因組為模板所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照。驗(yàn)證結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明ΔasfR敲除株中擴(kuò)增的條帶大小約1500bp(泳道4-16)，而野生型陽(yáng)性對(duì)照中擴(kuò)增的條帶大小約2000bp(泳道1)，表明重組菌株中目的基因asfR敲除成功。將PCR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果顯示ΔasfR的測(cè)序結(jié)果與WT中asfR基因編碼區(qū)域存在序列不一致的情況，而與asfR基因上下游同源臂序列完全一致，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)維氏氣單胞菌C4asfR基因敲除菌株ΔasfR已構(gòu)建成功(圖8)。
1.4asfR敲除對(duì)維氏氣單胞菌生長(zhǎng)的影響
為了分析asfR基因敲除后對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，我們分別在富營(yíng)養(yǎng)(LB培養(yǎng)基)和寡營(yíng)養(yǎng)(M9培養(yǎng)基)條件下比較維氏氣單胞菌C4野生型(WT)和ΔasfR的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，在富營(yíng)養(yǎng)條件下，WT和ΔasfR的生長(zhǎng)能力無(wú)明顯差異(圖9);但在寡營(yíng)養(yǎng)條件下培養(yǎng)大約5h時(shí)，ΔasfR菌株的生長(zhǎng)速度開始超過(guò)WT菌株，在培養(yǎng)至大約35h時(shí)，兩者的生長(zhǎng)差異達(dá)到最大(圖10)。該研究結(jié)果表明，asfR基因敲除能夠增強(qiáng)維氏氣單胞菌在營(yíng)養(yǎng)匱乏的逆境條件下的生長(zhǎng)能力。
1.5asfR基因敲除對(duì)生物膜形成的影響
采用結(jié)晶紫染色方法，探究asfR基因敲除對(duì)菌株生物膜形成的影響。將WT和ΔasfR菌株分別定量培養(yǎng)于96微孔板中，培養(yǎng)36h后，將96孔板中的培養(yǎng)液分別吸出，用無(wú)菌PBS沖洗，隨后經(jīng)0.5%結(jié)晶紫染色、無(wú)菌水沖洗、33%醋酸溶解等步驟后，測(cè)量吸光度值。結(jié)果顯示，與WT相比，ΔasfR的生物膜形成能力顯著較弱，二者之間具有極顯著性差異(P<0.01)(圖11)。結(jié)果表明AsfR對(duì)A.veroniiC4的生物膜形成能力具有促進(jìn)作用。
2討論
本研究基于同源重組原理，通過(guò)自殺質(zhì)粒與C4基因組兩次同源重組，對(duì)目的基因asfR進(jìn)行敲除。基于同源重組原理進(jìn)行的基因敲除，是目前研究生物體內(nèi)基因功能的一種重要且廣泛使用的方法，操作對(duì)象不限于細(xì)菌(Swingleetal.,2010)，古菌(王小利等，2015)，還包括真菌(SymingtonandGautier,2011)，植物(Reiss,2003)，動(dòng)物(Lanetal.,2016)等真核生物。同源重組技術(shù)通常將目的基因的上、下游同源臂分別通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶解，然后由DNA連接酶連接至自殺質(zhì)粒中(Celieetal.,2016)。該種方法需要保證DNA片段和質(zhì)粒同時(shí)具有所適用的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，而且有時(shí)需要進(jìn)行分步酶切，這增加了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜度，并會(huì)損耗實(shí)驗(yàn)樣品量(Shaoetal.,2009)。本研究在連接自殺質(zhì)粒之前，采用重疊延伸PCR技術(shù)連接asfR上/下同源臂，有利于降低多片段與載體連接的難度，并提高重組載體構(gòu)建成功率(Raymondetal.,1999;DahmandJennewein,2010)。隨后，本研究采用無(wú)縫克隆技術(shù)連接片段和載體。無(wú)縫克隆技術(shù)無(wú)需對(duì)目的基因片段進(jìn)行酶切，消除了限制性內(nèi)切酶的限制，簡(jiǎn)化了操作步驟(Birdetal.,2014)。
生物膜是與致病菌毒力相關(guān)的另一重要因素，生物膜的形成使得致病菌能夠耐受惡劣的生存環(huán)境，并對(duì)抗菌治療以及宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抵抗力，從而導(dǎo)致多種慢性疾病(Royetal.,2018)。群體感應(yīng)特性、胞外多糖(EPS)，以及由細(xì)菌鞭毛介導(dǎo)的游泳和群集運(yùn)動(dòng)等都是決定生物膜形成的重要原因(Packiavathyetal.,2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，asfR基因敲除株與維氏氣單胞菌野生型相比，其在富營(yíng)養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)能力沒(méi)有差別，但逆境環(huán)境下的生長(zhǎng)能力提高，而且其生物膜形成能力減弱。在維氏氣單胞菌胞外分泌產(chǎn)物的調(diào)控研究中報(bào)道了類似的現(xiàn)象，編碼胞外分泌產(chǎn)物組分的hisJ基因被敲除后，敲除株與野生型相比在富營(yíng)養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)能力無(wú)顯著差異，但生物膜形成能力下降，并且毒力也下降達(dá)865倍(Zhangetal.,2020)。由于asfR基因與Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)的鞭毛合成基因fliE相鄰，我們預(yù)測(cè)AsfR可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控鞭毛合成基因fliE，進(jìn)而對(duì)三型分泌系統(tǒng)，以及細(xì)菌毒力產(chǎn)生影響。本研究初步鑒定了未知蛋白AsfR的生物學(xué)功能，為研究維氏氣單胞菌的致病機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。
3材料與方法
3.1實(shí)驗(yàn)材料
自殺型質(zhì)粒pRE112、E.coliWM3064均為實(shí)驗(yàn)室所儲(chǔ)存;實(shí)驗(yàn)所涉及引物以及樣品測(cè)序由上海生工提供服務(wù)。本研究涉及的引物如表1所示。實(shí)驗(yàn)所用試劑盒以及其他實(shí)驗(yàn)試劑如表2所示。
3.2asfR基因上下游同源臂片段的擴(kuò)增
以維氏氣單胞菌基因組為模板，采用引物對(duì)asfRF1/R1擴(kuò)增目的基因asfR的上游同源臂片段，引物對(duì)asfRF2/R2擴(kuò)增下游同源臂片段。PCR加樣體系(50μL)為：基因組DNA2μL(30ng/μL)，2×PCRMix25μL，上/下游引物各2μL，ddH2O19μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃10min，95℃30S，56℃30S，72℃1min30S，30cycles，72℃10min。使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒將PCR擴(kuò)增獲得的asfR基因上下游同源臂片段進(jìn)行純化回收，于-20℃保存。
3.3重疊延伸PCR技術(shù)連接asfR基因上下游同源臂片段
以asfR基因上下游同源臂的重疊部分互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)行退火，延伸15個(gè)循環(huán)。PCR加樣體系(50μL)為：asfR基因上/下游同源臂DNA各2μL，2×PCRMix25μL，ddH2O21μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃10min，95℃30S，56℃30S，72℃1min30S，15cycles，72℃10min。在上述反應(yīng)體系中加入引物對(duì)asfRF1/R2各1μL，繼續(xù)20個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收及純化。
3.4pRE112-ΔasfR載體構(gòu)建
使用KpnI和SacI酶切pRE112質(zhì)粒。將酶切后的質(zhì)粒與融合的asfR同源臂按下列連接反應(yīng)體系(10μL)混合：4μLpRE112酶切產(chǎn)物(31ng/μL)，1μLasfR同源臂酶切產(chǎn)物(50ng/μL)，5μL2×ClonExpressMix。將連接產(chǎn)物于50℃連接5min，電擊轉(zhuǎn)化至E.coliWM3064感受態(tài)細(xì)胞中。將電轉(zhuǎn)后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有25μg/mLCam的抗性平板上，在37℃下倒置培養(yǎng)。菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子。
3.5細(xì)菌接合
將維氏氣單胞菌C4和攜帶pRE112-ΔasfR載體的E.coliWM3064分別于含25μg/mLCam和50μg/mLAmp的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。按0.02OD/mL轉(zhuǎn)接，并培養(yǎng)至OD值為0.4-0.6，將維氏氣單胞菌C4和E.coliWM3064按1:1，2:1，1:2的比例混合至終體積為800μL。6000rpm離心3min后棄上清，重懸菌體。取50μL滴于含有50μg/mLDAP的LB培養(yǎng)平板上，30℃倒置培養(yǎng)24h。刮取平板上的菌落，涂布于含有25μg/mLCam和50μg/mLAmp的雙抗平板上，菌落PCR驗(yàn)證接合子。
3.6蔗糖板篩選
挑取成功接合的單菌落，接種到LB培養(yǎng)基中，30℃過(guò)夜搖菌。取100μL菌液，涂布于8%蔗糖板上。于30℃下倒置培養(yǎng)24h。菌落PCR驗(yàn)證asfR敲除菌株，隨后送往上海生工測(cè)序。——論文作者：常慧敏馬香*李宏唐燕瓊王丹唐鴻倩劉柱
