發(fā)布時(shí)間：2019-11-28所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：【背景】鄂爾多斯地區(qū)傳統(tǒng)自然發(fā)酵苦菜風(fēng)味和作用獨(dú)特，但目前尚無關(guān)于發(fā)酵苦菜中乳酸菌種類及其生物學(xué)特性研究的報(bào)道。【目的】獲得適用于工業(yè)化生產(chǎn)特性優(yōu)良的乳酸菌。【方法】通過測(cè)定總酸度篩選高產(chǎn)酸菌株，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特性研究，
摘要：【背景】鄂爾多斯地區(qū)傳統(tǒng)自然發(fā)酵苦菜風(fēng)味和作用獨(dú)特，但目前尚無關(guān)于發(fā)酵苦菜中乳酸菌種類及其生物學(xué)特性研究的報(bào)道。【目的】獲得適用于工業(yè)化生產(chǎn)特性優(yōu)良的乳酸菌。【方法】通過測(cè)定總酸度篩選高產(chǎn)酸菌株，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特性研究，以及16SrRNA基因片段分析。【結(jié)果】經(jīng)鑒定5株高產(chǎn)酸的菌株均為植物乳桿菌，生長(zhǎng)溫度范圍寬，并且具有耐酸、耐堿、耐鹽、耐熱的特性。【結(jié)論】試驗(yàn)菌株具有優(yōu)良的生理特性和潛在的益生特性，可用于食品工業(yè)的生產(chǎn)。
關(guān)鍵詞：發(fā)酵苦菜，乳酸菌，高產(chǎn)酸，鑒定，生理生化特性
苦菜是菊科苦荬菜屬草本植物，在我國(guó)分布廣泛，具有清熱解毒、消炎抑菌、提高免疫力等食藥用功效[1]。在內(nèi)蒙古中西部及山西的許多地域，民間流傳著食用苦菜的習(xí)俗，而且在鄂爾多斯地區(qū)農(nóng)牧民在夏季將苦菜通過微生物作用酸漬保藏，可一直食用到冬季。這種發(fā)酵苦菜除了苦菜本身的作用，細(xì)菌的作用如何、細(xì)菌與苦菜的關(guān)系如何?在以苦菜為主料基質(zhì)中的乳酸菌又有什么特殊性?這些問題一直備受研究者關(guān)注。但目前國(guó)內(nèi)尚未有針對(duì)自然發(fā)酵苦菜中優(yōu)勢(shì)菌的分離及特性研究的報(bào)道。有研究報(bào)道自然酸漬蔬菜中的優(yōu)勢(shì)菌為乳酸菌，它具有抑制腸道病原菌、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等益生特性[2-3]。針對(duì)乳酸菌酸漬菜而言，乳酸菌的產(chǎn)酸量以及產(chǎn)酸條件直接影響酸漬產(chǎn)品的品質(zhì)和生產(chǎn)，所以高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選以及特性研究對(duì)乳酸菌在酸漬蔬菜中的應(yīng)用有重要意義。鑒于此，本研究從鄂爾多斯市白泥井鎮(zhèn)地區(qū)農(nóng)戶自然發(fā)酵腌制的苦菜汁中篩選出5株高產(chǎn)酸的乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定和生理特性的研究，這將為發(fā)酵蔬菜提供優(yōu)良菌種資源，并且為發(fā)酵蔬菜的工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為當(dāng)?shù)靥厣l(fā)酵食品有益作用的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品
采集自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達(dá)拉特旗白泥井鎮(zhèn)地區(qū)5戶農(nóng)戶家中的夏季腌制苦菜湯，共9個(gè)樣品。
1.1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株
植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CICC6238，代號(hào)為ZB，來自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
1.1.3培養(yǎng)基、主要試劑及儀器
TPY、MRS、GYP培養(yǎng)基及產(chǎn)酸菌株篩選培養(yǎng)基等均按照參考文獻(xiàn)[4-6]的方法配制。所用試劑均為分析純，購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;生化特性鑒定及糖發(fā)酵試驗(yàn)所用試劑均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司和杭州濱和微生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購于北京天根生物科技有限公司;DNAmarkerDL2000、6×Loadingbuffer和2×EasyTaqSuperMix購于TaKaRa生物工程(大連)有限公司。
紫外可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱，上海恒科技有限公司;電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司;光學(xué)顯微鏡，Olympus公司;PCR儀，AppliedBiosystems公司。
1.2方法
1.2.1酸性樣品乳酸菌的分離與純化
將酸苦菜湯樣品分別接種到TPY培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，將一代菌液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，得到的第2代菌液繼續(xù)接入MRS液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h得到活性較高的第3代菌液。將第3代菌液在產(chǎn)酸菌株篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，在37°C、7%CO2濃度條件下厭氧培養(yǎng)24−48h，挑取有明顯溶鈣圈的菌落，然后在MRS平板上繼續(xù)劃線分離純化，挑選革蘭氏染色陽性、H2O2酶陰性、無芽孢符合乳酸菌特征的單菌落，并油鏡鏡檢、保存，以備篩選、鑒定使用。
1.2.2供試菌液的制備
將保存的菌株活化3代，第3代菌液3000r/min離心10min，棄去上清液，收集菌體加入等量的無菌生理鹽水洗滌3次后，加入等量無菌生理鹽水混勻，待用。
1.2.3高產(chǎn)酸菌株的篩選
將保存的菌株活化3代，按1.2.2所示的方法制備供試菌液并接種到100mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)72h取發(fā)酵液lmL置于三角瓶中，用50mL蒸餾水稀釋，滴加2滴0.1%酚酞為指示劑，用0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定溶液至微紅色，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，每個(gè)菌株平行測(cè)定3次，酸度以100mL發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量計(jì)[7]。
1.2.4高產(chǎn)酸菌株的特性試驗(yàn)
(1)乳酸定性試驗(yàn)：對(duì)篩選出的高產(chǎn)酸菌株進(jìn)行薄層層析實(shí)驗(yàn)，以2%的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照。展開劑為水:苯甲醇:正丁醇=1:5:5(體積比)，并加入1%的甲酸。以0.04%的溴甲酚紫酒精溶液為顯色劑，待層析液揮發(fā)之后，向?qū)游霭鍑姙⒉⒂?jì)算Rf值[8]。
(2)形態(tài)特征觀察：將篩選到的高產(chǎn)酸菌株接種到MRS固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，觀察菌落特征，挑取典型單菌落，涂片進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察菌體的形態(tài)。
(3)生化特性試驗(yàn)：按照參考文獻(xiàn)[4-5,9]進(jìn)行H2O2酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性檢查、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)。以上試驗(yàn)均使用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CICC6238作為對(duì)照。
(4)16SrRNA基因片段序列分析：將活化好的3代菌液，按試劑盒說明提取各試驗(yàn)菌株的全基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA純度。PCR擴(kuò)增的引物為27F(5ʹ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)ʹ和1495R(5ʹ-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)ʹ，擴(kuò)增片段長(zhǎng)約1500bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(50μL)：模板DNA2μL，上、下游引物(10μmol/L)各2μL，2×EasyTaqSuperMix25μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件：94°C3min;94°C30s，65°C30s，72°C1min，共35個(gè)循環(huán);72°C5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
1.2.5生理特性研究
(1)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：將菌株按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、32、40、48、60、72h取樣測(cè)定OD600值;在0、2、4、8、12、16、20、24、28、32、40、48、60、72h取樣測(cè)定活菌數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。
(2)耐鹽試驗(yàn)：將菌株分別接種于NaCl濃度為0、2%、6%、10%(質(zhì)量體積比)的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，測(cè)定OD600值。
(3)pH試驗(yàn)：將菌株分別接種于pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、9.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，測(cè)定OD600值。
(4)溫度試驗(yàn)：將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別在15、25、45°C培養(yǎng)24h，測(cè)定OD600值。
(5)耐熱試驗(yàn)：將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，放置于60°C水浴鍋加熱處理30min，37°C培養(yǎng)24h，測(cè)定OD600值。以上試驗(yàn)均以不接菌的空白MRS培養(yǎng)基為對(duì)照。
2結(jié)果與分析
2.1酸性苦菜樣中乳酸菌的分離
從9個(gè)發(fā)酵苦菜樣品中分離得到了18株符合乳酸菌特性的菌，編號(hào)分別為1-1、1-2、2-11、2-17、3-1、3-2、3-3、5-3、5-4、6-5、6-6、7-1、7-4、7-5、7-9、9-3、9-5、9-8。
2.2高產(chǎn)酸菌株的篩選結(jié)果
測(cè)定18株菌的最終發(fā)酵酸度結(jié)果如圖1所示，在相同培養(yǎng)條件下，各菌株最終發(fā)酵酸度不同，篩選出5-4、7-5、1-2、1-1、6-6這5株產(chǎn)酸量較高的菌，其中5-4的酸度為2.479×10−2mol，7-5的酸度為2.447×10−2mol，1-2的酸度為2.436×10−2mol，1-1的酸度為2.424×10−2mol，6-6的酸度為2.427×10−2mol，而空白培養(yǎng)基的酸度為0.530×10−2mol，5株菌均比空白培養(yǎng)基的酸度提高近5倍，將所有平行測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，差異性顯著(P<0.05)。
期刊推薦：《微生物學(xué)通報(bào)》1974年創(chuàng)刊，是中國(guó)微生物學(xué)會(huì)和中國(guó)科學(xué)院微生物研究所主辦，國(guó)內(nèi)外公開發(fā)行，以微生物學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究及高新技術(shù)創(chuàng)新、應(yīng)用為主的綜合性學(xué)術(shù)期刊。刊登內(nèi)容包括：基礎(chǔ)微生物學(xué)研究;農(nóng)業(yè)微生物學(xué)研究;工業(yè)微生物學(xué)研究;醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究;食品微生物學(xué)研究;環(huán)境微生物學(xué)研究;微生物功能基因組研究;微生物蛋白組學(xué)研究;微生物模式菌株研究;微生物工程與藥物研究;微生物技術(shù)成果產(chǎn)業(yè)化及微生物教學(xué)研究改革等。本刊為中國(guó)生物科學(xué)類核心期刊。
讀者對(duì)象：主要來自科研院所、大專院校、醫(yī)院、衛(wèi)生防疫(檢疫監(jiān)察部門)、生物工程公司、環(huán)境保護(hù)、企業(yè)廠礦等單位。發(fā)行范圍涵蓋教育、科研、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)境、食品保健等領(lǐng)域。有投稿需求的作者，可以直接與期刊天空在線編輯聯(lián)系。
2.3高產(chǎn)酸菌株鑒定結(jié)果
2.3.1乳酸薄層層析定性結(jié)果
乳酸薄層層析定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為樣品的斑點(diǎn)與乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)處于同一位置，測(cè)定乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和篩選出的5株乳酸菌的Rf值并進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。Rf值為0.3−0.8，結(jié)果可信。
2.3.2形態(tài)特征鑒定結(jié)果
篩選的5株菌的菌落形態(tài)以及鏡檢結(jié)果如圖2和表2所示，5株菌的菌落均為圓形，但其直徑有較大差異，其中5-4的菌落為小菌落，1-2的菌落為大菌落，顏色均為乳白色，表面均光滑，邊緣整齊，鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陽性，無芽孢的短桿菌，符合乳酸菌的特征。
2.3.3生化特性鑒定結(jié)果
由表3結(jié)果可以看出，篩選出的5株菌過氧化氫酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)均為陰性，無運(yùn)動(dòng)性，可以利用葡萄糖但不產(chǎn)氣，因此可判定為同型發(fā)酵乳桿菌。
由表4糖發(fā)酵試驗(yàn)可見，篩選出的5株菌均可以利用D-核糖、阿拉伯糖、半乳糖、纖維二糖、果糖、水楊苷、蜜二糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖，均不能利用棉籽糖和木糖，對(duì)山梨醇、甘露醇和鼠李糖的發(fā)酵特性各不相同，其中菌株5-4可以利用山梨醇和鼠李糖，菌株1-1和7-5可以利用甘露醇。
分析上述試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[11]對(duì)菌株進(jìn)行種內(nèi)鑒定，菌株5-4與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)特性相似，但是不利用甘露醇，菌株7-5和1-1與小鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)特性相似，但不利用棉籽糖，菌株6-6和1-2的特性與米酒乳桿菌(Lactobacillussake)特性相似，但不利用山梨醇。由于傳統(tǒng)的發(fā)酵特性不穩(wěn)定因素較多，部分菌株親緣關(guān)系較近造成結(jié)果不容易區(qū)分[12]，所以需要進(jìn)一步通過16SrRNA基因片段序列分析來鑒定。
2.3.416SrRNA基因片段序列分析結(jié)果
用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析16SrRNA基因的PCR產(chǎn)物，如圖3所示，試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株均在1500bp處出現(xiàn)特異性目的條帶，與預(yù)期大小符合，而且產(chǎn)物條帶單一，滿足測(cè)序要求。
利用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)將5株菌的16SrRNA基因片段序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)，5株菌均與植物乳桿菌(L.plantarum)的相似度最高，可達(dá)99%。利用MEGA5.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行同源性分析，結(jié)果如圖4所示，5株試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株ZB均與植物乳桿菌(L.plantarum)的相似性最高，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支，與BLAST的分析結(jié)果相一致。可以判定5株菌均為植物乳桿菌(L.plantarum)。
2.4高產(chǎn)酸菌株的生理特性
2.4.1生長(zhǎng)曲線
由菌株的生長(zhǎng)曲線(圖5、6)和pH變化曲線(圖7)可以看出，菌株5-4和7-5的生長(zhǎng)情況基本相似，延滯期較短，約2h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，8h進(jìn)入穩(wěn)定期，32h進(jìn)入衰亡期，pH最低分別降至3.78和3.79。菌株1-1、1-2和6-6的生長(zhǎng)情況相近，4h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，8h進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)數(shù)期持續(xù)時(shí)間較短，但菌株生長(zhǎng)較快，1-1和1-2在28h進(jìn)入衰亡期，而菌株6-6在40h進(jìn)入衰亡期，而且活菌數(shù)降低較為緩慢。3株菌的pH變化曲線較為平緩，最低pH分別為3.01、3.00和2.98，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。
2.4.2耐鹽試驗(yàn)結(jié)果
由圖8可以得出，當(dāng)培養(yǎng)基的NaCl濃度為2%時(shí)，所有試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)基本不受影響;當(dāng)培養(yǎng)基的NaCl濃度為6%時(shí)，各菌株均受到輕微的抑制，而且受影響的程度相近;當(dāng)培養(yǎng)基的NaCl濃度為10%時(shí)，5株菌的生長(zhǎng)均受到明顯的抑制，受影響的程度同樣接近。
2.4.3pH試驗(yàn)結(jié)果
由圖9可見，培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)有較大的影響，試驗(yàn)的5株菌受初始pH的影響接近，在培養(yǎng)基pH<3.5時(shí)，所有試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)開始受到明顯的影響;其中菌株6-6在pH4.5時(shí)的OD600值顯著高于在其他pH，同樣也顯著高于其他試驗(yàn)菌株在pH4.5時(shí)的OD600值。
2.4.4溫度和耐熱試驗(yàn)結(jié)果
由圖10可以看出，試驗(yàn)菌株在25°C正常生長(zhǎng)，與標(biāo)準(zhǔn)37°C培養(yǎng)環(huán)境下的生長(zhǎng)情況相比無明顯差異;所有試驗(yàn)菌株在15°C生長(zhǎng)良好，受低溫影響不明顯，其中菌株1-1和1-2在15°C時(shí)的OD600值略高于其余3株試驗(yàn)菌株，45°C的高溫明顯影響菌株1-1和1-2生長(zhǎng)，說明菌株1-1和1-2在低溫下生長(zhǎng)良好，而試驗(yàn)菌株5-4、6-6和7-5受高溫影響不明顯，在45°C下的OD600值略低于37°C條件下的OD600值，它們適于較高溫度環(huán)境中生長(zhǎng)。
