發布時間：2019-11-28所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：【背景】16S rRNA 基因序列分析已廣泛應用于細菌的分類鑒定，但是存在一定局限性，而使用看家基因作為分子標記在近緣種及亞種間的系統發育分析中具有其獨特的優勢。【目的】研究 16S rRNA、uvrC (核酸外切酶 ABC，C 亞基)和 murE (UDP-N-乙酰胞壁酰三
摘 要：【背景】16S rRNA 基因序列分析已廣泛應用于細菌的分類鑒定，但是存在一定局限性，而使用看家基因作為分子標記在近緣種及亞種間的系統發育分析中具有其獨特的優勢。【目的】研究 16S rRNA、uvrC (核酸外切酶 ABC，C 亞基)和 murE (UDP-N-乙酰胞壁酰三肽合酶)基因序列對干酪乳桿菌的近緣種及亞種的區分能力。【方法】采用分離自傳統發酵乳中的 6 株干酪乳桿菌為研究對象，選取 uvrC 和 murE 基因片段，通過 PCR 擴增、測序，結合已公布的干酪乳桿菌的近緣種或亞種的相應序列計算遺傳距離、構建系統發育樹，并與 16S rRNA 基因序列分析技術進行比較。【結果】研究發現 Lactobacillus casei 及相近種間的 uvrC、murE 和聯合基因 (uvrC-murE)構建的系統發育樹拓撲結構與 16S rRNA 基因結果基本一致，區別在于相似性的不同，其分別為79.00%−99.16%、89.08%−99.20%、76.56%−99.69%和99.58%−100%。基于16S rRNA 基因不能區分干酪乳桿菌的近緣種及亞種，而看家基因 uvrC 和 murE 基因序列能夠很好地區分干酪乳桿菌的近緣種及亞種，并且將 uvrC 和 murE 基因串聯使用后，試驗菌株與參考菌株的分類關系更加清晰。【結論】聯合基因(uvrC-murE)可作為 16S rRNA 基因的輔助工具用于干酪乳桿菌的近緣種及亞種的快速準確鑒定。
關鍵詞：干酪乳桿菌，系統發育分析，16S rRNA 基因，uvrC，murE
干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)是革蘭氏陽性、兼性厭氧的乳桿菌屬中的一個種，對營養條件和發酵條件要求嚴格[1]。它通常存在于生乳或發酵乳制品、人和動物的腸道以及新鮮蔬菜或發酵蔬菜制品中[2]。干酪乳桿菌是一種具有調節腸道菌群平衡、促進人體消化吸收以及增強免疫等多種功能的益生菌[3-4]。本研究團隊自主分離、篩選自內蒙古地區傳統發酵酸馬奶中的 Lactobacillus casei Zhang 是性能優異的益生菌[5]，它具有較強的耐人工胃液、膽鹽消化、免疫調節、抗氧化等益生功效[6-9]。
長期以來，干酪乳桿菌及其近緣種的分類學地位一直存在爭議。干酪乳桿菌菌群經歷了從早期的 Lactobacillus casei subsp. casei、Lactobacillus casei subsp. alactosus、Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum 、 Lactobacillus casei subsp. tolerans 和 Lactobacillus casei subsp. rhamnosus，到 L. casei/paracasei、L. rhamnosus、L. zeae，直到現在 L. casei、L. paracasei、L. rhamnosus 的劃分[10-14]。由此可以看出，干酪乳桿菌及其近緣物種間的親緣關系錯綜復雜，種內分類學地位一直存在爭議，基于傳統的分類學方法只能勉強將其從種水平上區分開來，因此急需一種快速準確且分辨率較高的分類鑒定方法。隨著分子生物學技術的迅速發展，產生了許多新的分類鑒定方法，如隨機擴增 DNA 多態性[15]、種特異性 PCR[16]、核糖體分型[17]、轉錄間隔區序列分析[18]，但是以上方法在分類鑒定中存在一定的局限性。16S rRNA 基因序列的比較分析是細菌分類和鑒定的常用分子方法。但 Mori 等[19]研究發現干酪乳桿菌及其近緣種間的 16S rRNA 基因序列相似性超過 99%，因此使用該方法無法對干酪乳桿菌及其近緣種種內進行分類鑒定。劉光全等[20]嘗試采用不同看家基因分析干酪乳桿菌群的系統進化關系，同時證明看家基因 pheS比 16S rRNA 基因具有更高的分辨率。這提示我們，看家基因能夠區分鑒定干酪乳桿菌及其近緣種間的系統發育關系。
本研究分析了 12 株干酪乳桿菌的 16S rRNA、看家基因 uvrC (核酸外切酶 ABC，C 亞基)和 murE (UDP-N- 乙酰胞壁酰三肽合酶 ) 基因序列，與 GenBank 數據庫中下載模式菌株的 16S rRNA、 uvrC 和 murE 以及 uvrC-murE 串聯基因序列比對分析，對 12 株干酪乳桿菌的系統發育關系進行全面地闡述。本研究為我國優良益生菌株的篩選及快速鑒定奠定堅實的理論基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 試驗菌株
研究所用 6 株干酪乳桿菌均由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供，詳細信息見表 1。Bao 等[2]運用 10 種看家基因(carB、 clpX 、 dnaA 、 groEL 、 murE 、 pyrG 、 pheS 、 recA、rpoC、uvrC)對 224 株干酪乳桿菌進行多位點序列分型研究(MLST)，本研究從中隨機選取 6 株干酪乳桿菌(為了方便描述，下稱已發表菌株)，共構建 12 株菌的菌株集，以驗證本研究中分型方法的普適性。菌株的具體信息見表 2。另外，本研究還選取 5 株干酪乳桿菌及其近緣種的模式菌株作為參考菌株，具體信息見表 3。
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1.1.2 主要試劑和儀器
MRS 培養基，廣東環凱有限公司;PCR 試劑，大連 TaKaRa 公司;Applied biosystems PCR 儀，伯樂公司;微量紫外分光光度計，NanoDrop 公司;全自動高壓蒸汽滅菌器，Hirayama 公司;恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司;凝膠成像分析系統，UVP 公司;電熱恒溫培養箱，北京一恒科技有限公司;電子天平，上海精天電子儀器有限公司;高速冷凍離心機，Eppendorf 公司;電泳儀，北京六一生物科技有限公司。
1.1.3 試驗所用引物
通過比較基因組學分析，選擇 uvrC 和 murE 兩個單拷貝且含有多變區的基因為目標序列。結合序列比對信息，采用 Primer 5.0 設計通用引物(表 4)，引物由上海美吉生物醫藥科技有限公司合成。
1.2 DNA 提取、PCR 擴增和測序
采 用 CTAB-液氮凍融法提取菌株基因組 DNA[21]。將提取的基因組 DNA 稀釋至 100 ng/μL 左右作為PCR擴增模板。PCR反應體系(50 μL)：DNA 模板(100 ng/μL) 1 μL，10×Easy Taq buffer (Mg2+) 5 μL，High Pure dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，正、反向引物(10 mmol/L)各 1.5 μL，DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.5 μL，去離子水補充至 50 μL[22]。uvrC 基因的 PCR 反應條件：95 °C 5 min;95 °C 1 min，60 °C 45 s，72 °C 1 min，30 個循環;72 °C 10 min。murE 基因的 PCR 反應條件除了退火溫度為 52 °C，其余反應條件均與 uvrC 基因一致。PCR 產物用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將擴增成功的產物送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。
1.3 序列分析與系統發育樹的構建
6 株試驗菌株的 uvrC 和 murE 基因擴增產物經純化、測序獲得其相對應的核苷酸序列，上傳至 NCBI，已獲得登錄號(表 1)。所有菌株的 16S rRNA基因序列均下載自GenBank數據庫(序列登錄號見表 1、表 2 和表 3)，6 株已發表菌株及 5 株參考菌株的 uvrC 和 murE 基因序列從 GenBank 數據庫中下載(序列登錄號見表 2、表 3)。采用 MEGA 6.0 軟件進行 ClustalW 比對，運用鄰接法 (Neighour-Joining，N-J)分別構建基于 16S rRNA、 uvrC 和 murE 基因序列以及 uvrC-murE 串聯序列的系統發育樹，數據自展重復抽樣次數 1 000 次。
2 結果與分析
2.1 基于 16S rRNA 基因的系統發育分析
根據 12 株試驗菌株和 5 株參考菌株的 16S rRNA 基因序列，采用 N-J 法構建系統發育樹，計算其進化距離，結果如圖 1 所示。結果顯示， 17 株菌共劃分為兩大類(I、II)，I 類群分為 2 個亞群(A、B)。I 類群的 A 亞群中 12 株菌株與 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 、 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 聚為一類，它們兩兩之間的16S rRNA基因序列平均相似性均為 99.99%。其中，模式菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 和 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 以 100%的相似性聚為一類。 A 亞群菌株與 B 亞群中的菌株 L. casei DSM20011T 、L. zeae DSM20178T 兩兩之間的平均相似性為 99.70%。I 類群與 II 類群的平均差異性較小，僅為 0.46%。
劉光全等[20]研究發現干酪乳桿菌與其近緣種的一致性都在 99%以上，二者不能通過 16S rRNA 基因被有效區分開。本研究得到相同的結果， 16S rRNA 基因序列很難區分干酪乳桿菌的近緣種及亞種，需要選用一種比 16S rRNA 基因分辨率高的方法對其進行分類鑒定。
2.2 基于 uvrC 基因部分序列的系統發育分析
基于 uvrC 基因部分序列構建的系統發育樹中，12株試驗菌株與5株參考菌株構建的系統發育樹仍形成較為穩定的兩個大類(I、II)，I 類群分成 3個亞群(A、B、C)，但相似性與16S rRNA基因不同。如圖 2 所示，I 類群中 12 株菌株和 3 株參考菌株聚為一類。 A 亞群即菌株 IMAU10787 、 IMAU70074、IMAU10541、IMAU70046 與參考菌株 L. casei DSM20011T 為一個分支，菌株 IMAU80810、IMAU80732、IMAU80853 與參考菌株 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T聚為一小分支，菌株 IMAU10532 、 IMAU80452 、 IMAU10847、IMAU20578 和參考菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T聚為 C 類，它們基因序列兩兩之間的相似性大于 97.38%。IMAU80303 未與參考菌株劃分為一類，它與模式菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 、 L. casei DSM20011T 、 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 的相似性分別為 98.46%、99.12%、 98.68%。A亞群與B亞群兩兩菌株之間的基因平均相似性為 81.63%，與 C 亞群之間基因平均相似性為 79.00%。Ⅱ類群中 L. rhamnosus DSM20021T和 L. zeae DSM20178T的基因差異性為 19.16%，比 16S rRNA 基因序列有更大的差異性。結果顯示，相較于 16S rRNA 基因序列，uvrC 基因序列在干酪乳桿菌的近緣種及亞種的分類中有較高的分辨率。
2.3 基于 murE 基因部分序列的系統發育分析
基于 murE 基因部分序列構建的系統發育樹如圖 3 所示，12 株菌與 5 株參考菌構建的系統發育樹仍形成較為穩定的兩個大類(I、II)。I 類群中 12 株菌和 3 株參考菌聚為一類，I 類群又分為 3 個小的分支(A、B、C)。菌株 IMAU80303、IMAU10847 和參考菌株L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T 聚為一小分支，菌株 IMAU10532、IMAU80853、 IMAU80452 、 IMAU80810 、 IMAU20578 、 IMAU80732 與參考菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 聚 為 B 類，菌株 IMAU10541 、 IMAU70046、IMAU10787、IMAU70074 與參考菌株 L. casei DSM20011T聚為另一分支。它們基因序列兩兩之間的相似性大于 98.81%。A 亞群與 B 亞群兩兩菌株之間的基因平均相似性為 92.47%，與 C 亞群之間基因平均相似性為 89.08%。模式菌株 L. paracasei subsp. tolerans DSM20258T 和 L. paracasei subsp. paracasei DSM5622T的平均差異達到 0.2%，比 16S rRNA 基因序列有更大的差異性。結果表明，murE基因區分干酪乳桿菌的近緣種及亞種的分辨率高于 16S rRNA 基因，因此利用 murE 基因能很好地區分干酪乳桿菌的近緣種及亞種。
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