發(fā)布時間：2019-11-28所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要: 倉儲生態(tài)因子和煙葉化學(xué)成分的改變直接影響煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。以儲存在貴陽庫( GY) 、壇廠庫( TC) 及紫云庫( ZY) 的云南保山 C3F 煙葉為研究對象，對不同陳化時間( 0、6、12、18、24 個月) 的煙葉樣品提取微生物總 DNA，利用 Illumina HiSeq
摘要: 倉儲生態(tài)因子和煙葉化學(xué)成分的改變直接影響煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。以儲存在貴陽庫( GY) 、壇廠庫( TC) 及紫云庫( ZY) 的云南保山 C3F 煙葉為研究對象，對不同陳化時間( 0、6、12、18、24 個月) 的煙葉樣品提取微生物總 DNA，利用 Illumina HiSeq 平臺對細(xì)菌的 16S rRNA V4 區(qū)進(jìn)行高通量測序，并結(jié)合主要化學(xué)成分分析，以期揭示煙葉陳化過程中細(xì)菌群落演替規(guī)律及其與煙葉化學(xué)成分間的作用關(guān)系。研究結(jié)果表明，煙葉細(xì)菌群落以假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬; 隨陳化時間的增加，細(xì)菌優(yōu)勢群落呈現(xiàn)出變形菌門和厚壁菌門間消長變化的趨勢，陳化后期芽孢桿菌( 厚壁菌門) 優(yōu)勢度明顯增強(qiáng); 煙葉陳化過程中，細(xì)菌優(yōu)勢功能群變化與化學(xué)成分逐級降解間呈顯著的相關(guān)關(guān)系，主要表現(xiàn)為由降解糖類菌群向降解淀粉類菌群，再向降解纖維素類菌群變化的趨勢; 其中，影響菌群演替的關(guān)鍵因素是水溶性總糖和纖維素。研究結(jié)果揭示了在煙葉陳化過程中存在顯著的細(xì)菌群落演替特征，加深了對煙葉陳化機(jī)制的理解，為微生物調(diào)控?zé)熑~陳化過程提供了科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞: 高通量分析; 群落結(jié)構(gòu); 演替規(guī)律; 化學(xué)組分
煙葉陳化是指在人工可控的倉儲環(huán)境下煙葉與微生物及環(huán)境相互作用的發(fā)酵過程，在此過程中，倉儲環(huán)境因子( 溫度、濕度等) 、煙葉化學(xué)組分( 總糖、蛋白質(zhì)、淀粉、生物酶等) 含量、煙葉水分及酸堿度等與煙葉表面微生物彼此聯(lián)系、互相促進(jìn)、互相制約共同構(gòu)成了煙葉陳化的特定生態(tài)系統(tǒng)，并在物質(zhì)流、能量流和基因流 “三流運(yùn)轉(zhuǎn)”規(guī)律的交互作用下構(gòu)成了煙葉微生態(tài)的動態(tài)發(fā)展和特定階段的動態(tài)平衡[1]。環(huán)境信息的傳遞和煙葉化學(xué)物質(zhì)的改變直接或間接的影響著煙葉微生物的種類和數(shù)量及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與積累，并最終決定著物質(zhì)和能量的走向[2-3]，因此，研究倉儲生態(tài)因子和煙葉化學(xué)成分的改變對煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響具有重要意義。隨著煙葉陳化的不斷進(jìn)行，微生物群落的消長演替又會引起煙葉組分微環(huán)境的變化[4]，如蛋白質(zhì)、淀粉、糖類、纖維素等大分子物質(zhì)降解[5-6]及紫羅蘭酮、大馬酮、糠醛等小分子物質(zhì)產(chǎn)生[7-8]。環(huán)境因子變化也會作用于微生物，并導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物的成分和比例發(fā)生變化，最終形成產(chǎn)品特有的生態(tài)風(fēng)味[9]，所以，研究微生物群落動態(tài)變化對了解煙葉陳化生態(tài)系統(tǒng)的運(yùn)行很有必要。
煙葉陳化過程中占優(yōu)勢的微生物群落以細(xì)菌類為主[10]，但是目前 90%—99%的微生物處于不可培養(yǎng)狀態(tài)[11]，因此本研究依托二代測序的技術(shù)優(yōu)勢[12]對樣品中微生物菌群進(jìn)行分析，同時結(jié)合分析陳化過程中煙葉化學(xué)組分的變化，揭示細(xì)菌群落變化過程與煙葉化學(xué)組分之間作用規(guī)律，加深對煙葉陳化機(jī)制的理解。
1 材料與方法
1.1 材料
樣品: 分別陳化了 0、6、12、18、24 個月的云南保山 C3F 煙葉樣品( 產(chǎn)地: 云南保山地區(qū); 品種: 云 87; 等級: C3F) ; 采集地: 貴陽庫( GY) 、壇廠庫( TC) 、紫云庫( ZY) ; 采集方式: 除去煙箱表層煙葉，按五點(diǎn)式收集煙葉樣品，500g，存于-20℃ 冰箱中，各庫樣品同一時間內(nèi)采集; 采集時間: 2014 年 7 月、2015 年 1 月、2015 年 7 月、 2016 年 1 月、2016 年 7 月; 編號: GY-0、TC-0、ZY-0、GY-6、TC-6、ZY-6、GY-12、TC-12、ZY-12、GY-18、TC-18、ZY- 18、GY-24、TC-24、ZY-24。
1.2 方法
1.2.1 煙葉微生物收集與總 DNA 提取
參照 Zhao 等[13]和 Su 等[14]的網(wǎng)膜法收集煙葉總微生物。稱取 60g 煙葉樣品，剪碎，平均分成 3 份，分別置于 3 個裝有 200mL pH = 7.0 磷酸緩沖溶液( PBS) 的三角瓶中，27℃、200r /min 震蕩培養(yǎng) 1h; 用已滅菌的雙層紗布過濾培養(yǎng)物，收集濾液; 6000r /min 室溫離心 30min，收集沉淀; 加入 20mL PBS 緩沖液，重新制成菌懸液， 6000r /min 離心，收集沉淀，最后將相同樣品的沉淀物匯集到一起，即為煙葉總微生物。參照 OMEGA 公司 E. Z.N.A. SoiL DNA Kit 試劑盒說明方法提取微生物總 DNA。提取的總 DNA 送北京諾和致源科技股份有限公司進(jìn)行高通量測序。
1.2.2 PCR 擴(kuò)增及高通量測序
選取 16S rRNA 基因 V4 片段進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物使用 HiSeq2500 PE250 進(jìn)行上機(jī)測序。選用引物: 515F( 5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') 和 806R( 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 。反應(yīng)體系( 30μL) : Phusion Master Mix( 2×) 15μL; Primer1( 2μmol /L) 1.5μL; Primer2( 2μmol /L) 1.5μL; DNA 模板( 1ng /μL) 10μL; H2O 2μL。反應(yīng)程序: 98℃預(yù)變性 1min; 98℃ 10s，50℃ 30s，72℃ 5min，共 30 個循環(huán); 72℃延伸 5min。
1.2.3 化學(xué)物質(zhì)檢測
參照李永忠等[15]方法進(jìn)行煙葉常規(guī)化學(xué)物質(zhì)檢測，每個樣品設(shè)置 3 個重復(fù)。有機(jī)碳采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化容量法; 全氮采用H2 SO4-H2O2消化-蒸餾法; 全磷采用 H2 SO4-H2O2消化-鉬黃比色法; 全鉀采用 H2 SO4-H2O2消化-火焰分光光度法; 水溶性總糖采用 80%酒精浸提-蒽酮比色法; 煙堿采用堿蒸餾-紫外分光光度法; 淀粉采用稀酸水解-蒽酮比色法; 蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法; 粗纖維采用酸堿洗滌-重量法; 石油醚浸提物采用石油醚浸提-重量法。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理
①序列處理及 OTU 注釋: 根據(jù) Barcode 序列和 PCR 擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去 Barcode 和引物序列后使用 FLASH[16]對每個樣品的 Reads 進(jìn)行拼接，得到原始 Tags 數(shù)據(jù); 參照 Qiime[17]的 Tags 質(zhì)量控制流程，經(jīng)過 Tags 截取、過濾及嵌合體去除等處理后得到高質(zhì)量的有效 Tags 數(shù)據(jù)。利用 Uparse 軟件，以 97%的一致性將序列聚類為 OTUs( Operational Taxonomic Units) ，選取 OTUs 的代表性序列用 Mothur 方法與 SSU rRNA 數(shù)據(jù)庫對 OTUs 進(jìn)行物種注釋，并在 OTU 水平上進(jìn)行 α 多樣性分析。
②細(xì)菌群落動態(tài)變化分析: 通過韋恩圖分析陳化不同時間的樣品 OTUs 分布差異; 根據(jù)所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前 35 的類群，從物種和樣品兩個層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖，分析不同陳化時間樣品優(yōu)勢細(xì)菌類群變化情況; 通過 LEfSe 系統(tǒng)分析不同陳化時間的樣品間顯著差異的物種。
③細(xì)菌群落變化與化學(xué)成分關(guān)系分析: 結(jié)合不同陳化時間優(yōu)勢細(xì)菌及關(guān)鍵類群，利用 SPSS 19. 0、 CANOCO 5等統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對細(xì)菌群落與各化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析和冗余分析( RDA) 。
2 結(jié)果與分析
2.1 高通量測序結(jié)果
Shannon-Winner 指數(shù)曲線可反映各樣本的物種多樣性隨測序量的變化情況[18]。如圖 1 所示，隨著樣品序列數(shù)的增加，Shannon-Winner 指數(shù)曲線越趨向平坦，表明本試驗(yàn)測序的數(shù)據(jù)深度能較全面地反應(yīng)測序樣品中微生物信息。
樣品 DNA 高通量測序結(jié)果如表 1 所示，經(jīng)拼接、優(yōu)化、過 濾 后 得 到 1191887 條 有 效 序 列，每 個 樣 品 得 67940—86235 條; 以 97%的一致性將序列聚類，平均得到 1099 個 OTU。對不同樣品的 α 多樣性指數(shù)進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，樣品細(xì)菌豐富度的 Chao1 指數(shù)和 ACE 指數(shù)分別在 510. 34—3528. 94 和 520. 33—2226. 74 之間。反映菌 群 多 樣 性 的 Shannon 和 Simpson 值 分 別 達(dá) 到 3.47—6.59 和 0.70—0.96。其中，樣品 GY-0 細(xì)菌最豐富，多樣性最大，Shannon 指數(shù)達(dá) 6.59，樣品 ZY-18 多樣性最低，Shannon 指數(shù)為 3.47; 樣品 GY-24 和 TC-0 均勻性最好，Simpson 指數(shù)均達(dá)到 0.97，ZY-18 均勻性最差，Simpson 指數(shù)為 0.70。所有樣品 Coverage 指數(shù)均達(dá)到 0.98以上，表明本次研究所測得的數(shù)據(jù)足夠反應(yīng)煙葉細(xì)菌群落的多樣性。
2.2 細(xì)菌群落組成
煙葉細(xì)菌種類豐富，分屬于 493 個屬，每個樣品相對豐度大于 1.0%的類群組成，如圖 2 所示( < 1.0%的歸于 Others) 。假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、芽孢桿菌屬為主要優(yōu)勢類群，其中，假單胞菌屬占主導(dǎo)優(yōu)勢，占 17.8%—44.3%，其次是鞘氨醇單胞菌屬，占 8.0%—23.6%。
2.3 不同陳化時間煙葉細(xì)菌群落動態(tài)演替分析
2.3.1 OTU 變化分析
在 OTU 水平上繪制韋恩圖，如圖 3 所示。貴陽庫( 圖 3A) 樣品有 313 個共有 OTUs，陳化 0、6、12、18、24 個月時分別有 267、110、90、120、159 個特有 OTUs。壇廠庫( 圖 3B) 樣品有 170 個共有 OTUs，陳化 0、6、12、18、24 個月時分別有 249、82、126、115、262 個特有 OTUs。紫云庫( 圖 3C) 樣品有 176 個共有 OTUs，陳化 0、6、12、18、 24 個月時分別有 192、97、140、41、264 個特有 OTUs。共有的 OTUs 表明這些細(xì)菌類群的作用在煙葉陳化過程中貫穿于陳化的始終，是煙葉陳化的主要細(xì)菌類群; 不同陳化階段特有 OTUs 表明煙葉陳化過程中功能細(xì)菌群落與陳化進(jìn)程密切相關(guān)，演替現(xiàn)象明顯。
2.3.2 優(yōu)勢細(xì)菌類群變化分析
針對陳化不同時間對所有樣品進(jìn)行組合分析，發(fā)現(xiàn)煙葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨陳化時間的延長發(fā)生了較大變化 ( 圖 4 ) 。 陳化開始時擬桿菌門的 Sphingobacterium，變 形 菌 門 的 Steroidobacter、Aquicella、Legionella、 Pseudoxanthomonas、Methylobacterium 及 厚 壁 菌 門 的 Romboutsia 等 類 群 占 優(yōu) 勢。6 個月時變形菌門的 Pusillimonas 和 Vulgatibacter 占優(yōu)勢。12 個月時綠彎菌門的 unidentified_Anaerolineaceae 占優(yōu)勢。18 個月時，所有類群的豐度都相對較低，變形菌門的 Pusillimonas 占優(yōu)勢。24 個月時，變形菌門的 Stenotrophomonas 和 Comamonas，厚壁菌門的 Solibacillus、Bacillus、Staphylococcus、Paenibacillus 及放線菌門的 Kocuria 等類群優(yōu)勢明顯。
整體來看，隨著煙葉陳化時間的增加，細(xì)菌優(yōu)勢類群種類先減少后增加，其中變形菌類逐漸減少，厚壁菌類和放線菌類逐漸增加，這種變化與李曉強(qiáng)研究結(jié)果相似[19]。
2.3.3 關(guān)鍵細(xì)菌類群變化分析
通過 LEfSe 分析( LDA 值默認(rèn)為 4) 發(fā)現(xiàn)，在煙葉陳化 0、12、24 個月時樣品之間具有顯著差異的細(xì)菌類群，結(jié)果如圖 5 所示。陳化開始時 Methylobacterium 差異顯著，起重要作用。陳化 12 個月時 Enterobacteriaceae起重要作用。陳化 24 個月時 Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas 差異明顯，發(fā)揮重要作用。 LEfSe 分析表明隨煙葉陳化時間延長，關(guān)鍵優(yōu)勢菌群發(fā)生一系列演變，先 是 由 Methylobacterium 向 Enterobacteriaceae 演變，隨后向 Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas 變化。其中，Methylobacterium、 Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas、Enterobacteriaceae 均屬于變形菌門類群，Bacillus 屬于厚壁菌門類群，因此，隨陳化時間延長，厚壁菌門優(yōu)勢逐漸增加，芽孢桿菌優(yōu)勢度后期明顯增強(qiáng)。
2.4 細(xì)菌群落演替與煙葉化學(xué)成分的關(guān)系
RDA 分析結(jié)果中，軸 1 和軸 2 累積變量分別為 50.70%和 73.24%，化學(xué)物質(zhì)變化對細(xì)菌群落演替整體解釋量為 78.90%。據(jù)圖 6 和表 2 可知，水溶性總糖對細(xì)菌群落動態(tài)影響最大，其次是纖維素。陳化開始時 ( Ⅰ) ，水溶性總糖貢獻(xiàn)最大，與 Pusillimonas 顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為- 0. 546，與 Steroidobacter、Romboutsia、 Clostridium_sensu_stricto_1、Legionella 顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.613、0.613、0.656、0.517。陳化 12 個月時 ( Ⅱ) ，淀粉、石油醚浸提物及總氮、總磷等影響最大，石油醚浸提物與 Xanthomonas 呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.541，與 Pusillimonas、Vulgatibacter 呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 0.579、0.524; 總磷與 Xanthomonas 呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.528。陳化 24 個月時( Ⅲ) ，纖維素作用最明顯，與 Staphylococcus、Aureimonas、Massilia 呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 0.562、0.539、0.528。隨著時間的延長，細(xì)菌群落發(fā)生了由降解糖類向降解淀粉類菌群變化，再向降解纖維素類菌群變化的演替現(xiàn)象，這與化合物的逐級降解相關(guān)。
相關(guān)期刊推薦：《生態(tài)學(xué)報(bào)》(半月刊)創(chuàng)刊于1981年，是由中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會主管、中國生態(tài)學(xué)學(xué)會中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心主辦的我國生態(tài)學(xué)及生態(tài)學(xué)各分支學(xué)科研究領(lǐng)域的綜合性學(xué)術(shù)期刊。內(nèi)容涵蓋：動物、植物、微生物、農(nóng)業(yè)、森林、草地、土壤、海洋、淡水、景觀、區(qū)域、化學(xué)、污染、經(jīng)濟(jì)、系統(tǒng)、城市、人類生態(tài)等生態(tài)學(xué)及各分支學(xué)科理論與實(shí)踐研究。有投稿需求的作者，可以直接與期刊天空在線編輯聯(lián)系。
