發(fā)布時間：2020-04-01所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要目的確定以大腸桿菌表達丁肝抗原的最佳條件，為規(guī)模生產(chǎn)以求研發(fā)丁肝ELISA診斷試劑奠定基
摘要目的確定以大腸桿菌表達丁肝抗原的最佳條件，為規(guī)模生產(chǎn)以求研發(fā)丁肝ELISA診斷試劑奠定基礎(chǔ)。方法在不同溫度、時間、IPTG和菌種濃度條件下，分別進行蛋白表達，取等體積樣本進行SDS—PAGE電泳，經(jīng)ImageLab軟件分析，比較目的蛋白表達量，確定最佳表達條件。結(jié)果在25℃、29~C、33oC和37~C條件下，蛋白表達量無統(tǒng)計意義的差別;在添加IPTG后的1、2、3、4、5和6h，表達量無統(tǒng)計意義的差別;在以0.25、0.5、1、2和4mmol/LIPTG誘導(dǎo)時，表達量無統(tǒng)計意義的差別。當(dāng)添加誘導(dǎo)劑前，菌種的ODo。值分別為1.236、0.772、0.542和0.384，目的蛋白表達量有顯著意義的差別。以O(shè)D值為1.236和0.772時，表達量最高，兩者之間無統(tǒng)計意義的差別;OD。。值為0.542時，表達量次之;OD。。值為0.384時，表達量最低。結(jié)論溫度、表達時間和IPTG濃度在一定范圍內(nèi)對丁肝抗原蛋白表達量無影響;菌種的濃度是影響蛋白表達量的決定性因素;當(dāng)菌種濃度在OD值約為0.7～1.2時，以0.25mmol/LIPTG在37℃，誘導(dǎo)表達1h為最佳表達條件。該條件下，目的蛋白表達量占菌體總蛋白的41.5%。
關(guān)鍵詞丁肝基因工程抗原表達
丁型肝炎病毒(HDV)是一種缺陷型負鏈RNA病毒，需依賴乙型肝炎病毒(HBV)或其他嗜肝DNA病毒的幫助才能復(fù)制和傳播¨。HDV與HBV同時或重疊感染，可造成原有病情加重，或發(fā)展成為肝硬化甚至暴發(fā)性肝炎。我國是乙型病毒性肝炎的高流行區(qū)，當(dāng)前乙型肝炎病毒表面抗原(HBAg)的陽性率仍大于8%E33，這說明丁型肝炎作為依托乙型肝炎病毒感染的疾病，仍嚴重威脅著我國人民的健康。只有對丁型肝炎及時準(zhǔn)確的診斷，才能為其治療和防控工作奠定基礎(chǔ)。以酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定丁肝抗原或抗體是診斷丁肝的主要手段。為提高和改進我國當(dāng)前HDVELISA診斷試劑的質(zhì)量，大量獲取高純度、好活性的丁肝抗原是進一步開展研發(fā)工作的首要條件。本文從不同角度探討溫度、時間、誘導(dǎo)劑和菌種濃度等對丁肝抗原表達量的影響，從而確定其表達的最佳條件，為批量生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
材料與方法
1.材料：丁肝抗原優(yōu)化基因由北京六合通公司合成;表達載體M48由本室從商品化質(zhì)粒PET43a改造并留存;BL21感受態(tài)(北京六合通公司);LB培養(yǎng)基(美國，Sigma);TZ一2H臺式恒溫振蕩培養(yǎng)箱(北京沃德創(chuàng)新醫(yī)藥科技中心);垂直電泳系統(tǒng)(美國，Bio—rad);蛋白彩色Marker(紐英倫生物技術(shù)北京有限公司);蛋白Marker(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院);GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)和ImageLab分析軟件(美·32·國，Bio—rad);H一15FR低溫離心機(美國，KOKUSAN);GGT一900超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠);XMTD一6000電熱恒溫水槽(北京市長風(fēng)儀器儀表公司);酶標(biāo)儀(美國，Ther—mo)。
2.方法：(1)菌種的培養(yǎng)：將含丁肝抗原優(yōu)化基因的M48質(zhì)粒，常規(guī)轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，挑取單斑菌，接種于1.5ml含100IXg/mlAmp的LB培養(yǎng)基中，37℃，240r/min，振蕩培養(yǎng)3h;再取該菌按1：100接種于3ml含100ixg/mlAmp的LB培養(yǎng)基中，37℃，240r/min，振蕩培養(yǎng)2h;再取該菌按1：1000分別接種于2.4L含100p~g/mlAmp的LB培養(yǎng)基中，30~C，240r/min，振蕩培養(yǎng)過夜;以含100Ixg/mlAmp的LB培養(yǎng)基做倍比稀釋，37℃，240r/min，振蕩培養(yǎng)1h后，作為測定不同溫度、時間和IPTG濃度對蛋白表達量影響的實驗用菌種。不同菌種濃度對蛋白表達量影響的實驗用菌，視過夜菌梯度稀釋后，在37oC，240r/min，振蕩培養(yǎng)過程中的OD值而采集。(2)不同條件下的蛋白表達：取lOOml的三角瓶，分裝30ml上述菌種，分別添加IPTG至終濃度為0.25、0.5、1、2、4mmol/L，同時設(shè)不加IPTG的對照，再依次分別置于25℃、29℃、33℃和37℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，240r/min，震蕩培養(yǎng)，每種不同條件的樣本均設(shè)3例。于培養(yǎng)1、2、3、4、5和6h時，以EP管分別取樣500IXl，lO000r/min，離心1min，棄上清，一20℃凍存?zhèn)錂z。(3)電泳：將上述樣本以5O1雙蒸水充分重懸，再加等體積2×Bufer，混勻，煮沸3min，取樣2Ol，以5%濃縮膠和13%分離膠進行常規(guī)SDS—PAGE。(4)軟件分析：以GelDocXR+凝膠成像拍照，留存;用ImageLab軟件對蛋白條帶進行分析。
結(jié)果
1.不同誘導(dǎo)劑濃度條件下蛋白表達結(jié)果：在IPTG濃度分別為0.25、0.5、1、2、4mmol/L的條件下，均有分子質(zhì)量約為35kDa的外源性蛋白表達;且經(jīng)ImageLab軟件分析，其表達量無統(tǒng)計意義的差別，如圖1示。
2.不同溫度條件下蛋白表達結(jié)果：在25℃、
29℃、33℃和37℃條件下，均有分子質(zhì)量約為35kDa的外源性蛋白表達;且經(jīng)ImageLab分析，其表達量無統(tǒng)計意義的差別，如圖2示。
3.不同表達時間蛋白表達結(jié)果：當(dāng)表達時間分別l、2、3、4、5和6h時，均有分子量質(zhì)約為35kDa的卜源性蛋白表達;且經(jīng)ImageLab分析，其表達量無計意義的差別，如圖3示。
4.不同菌種濃度蛋白表達結(jié)果：誘導(dǎo)不同濃度的菌種，均有分子質(zhì)量約為35kDa的外源性蛋白表達;經(jīng)lmageLab分析，其表達量有統(tǒng)計意義的差別。在0Dn為1.236和0.772時，表達量最高，且兩者之間無統(tǒng)計意義的差別;ODomm為0.542時，表達量次之;ODo值為0.384時，表達量最低，如圖4示。
5.目的蛋白的含量：以lmageLab對表達產(chǎn)物進行定量分析，第6峰為目的蛋白(圖5)，約占菌體總蛋白的41.5%。
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討論
目前，大腸桿菌已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中最常用的材料之一，廣泛用于外源蛋白的原核表達。外源蛋白在大腸桿菌中的表達受多種因素的影響(5-]。
主要有外源基因的結(jié)構(gòu)，表達載體和宿主菌的選擇，表達條件及營養(yǎng)狀況等。因此，對不同的基因必須對誘導(dǎo)條件進行優(yōu)化，尋找適宜的表達條件，才能獲得最大程度的表達。
當(dāng)異源目的基因的mRNA在大腸桿菌中過表達時，tRNA的數(shù)量直接反映了mRNA的密碼子偏倚性[。不充足的1RNA庫可能導(dǎo)致翻譯延遲、成熟前翻譯終止、翻譯移碼和氨基酸錯配。盡管少量稀有密碼子的出現(xiàn)通常不會給目的蛋白的合成造成太大影響，不過如果一個基因中含有成串或多個大腸桿菌稀有密碼子，外源蛋白的表達將非常低¨。為此，本研究所用基因采用人工編碼，選用大腸桿菌的高頻密碼子，避免因tRNA的稀有或缺少而導(dǎo)致的翻譯停止。湯少華等報道，丁肝病毒抗原蛋白編碼區(qū)約230bp的基因表達即可獲得有效的抗原蛋白，本研究所用基因優(yōu)化后為596bp，所獲蛋白具有良好的抗原性(具體結(jié)果另文發(fā)表)。
本實驗選用含硫氧還蛋白的M48(系本室由PET43a改造而來)融合蛋白表達系統(tǒng)，借助硫氧還蛋白分子伴侶的作用¨，表達出的蛋白既能正確折疊又能表現(xiàn)出全部生物學(xué)活性。M48載體多克隆酶切位點的上游插入有編碼6個組氨酸的序列，可與目的蛋白融合表達，利用6xHisTag和金屬鎳的親和力所產(chǎn)生的螯合作用而設(shè)計的親和層析方法，可以有效純化此蛋白;同時，M48含T7強啟動子，該啟動子對T7RNA聚合酶啟動轉(zhuǎn)錄具有特異性，不僅轉(zhuǎn)錄效率高而且轉(zhuǎn)錄物完整，保證了表達rHDAg的完整性和高效性。
一般認為，溫度是影響蛋白表達的重要因素，溫度越高，蛋白表達量越大，且易形成包涵體’”’。本研究其他實驗已證實，此蛋白37℃表達依然可溶(結(jié)果另文發(fā)表)。本實驗進一步證實，在一定范圍內(nèi)，溫度變化對其表達量無明顯影響。因37℃是大腸桿菌的最適生長溫度，所以確定在37℃進行表達。
蛋白表達時間一直是備受關(guān)注的問題，時間太短表達量少;時間長了又因蛋白酶的釋放而降解。因本研究采用BL21作為表達菌株，其蛋白酶含量極少，使表達蛋白不致被水解，為表達蛋白的穩(wěn)定性提供了可靠保障。經(jīng)本實驗證實，表達時間在一定范圍內(nèi)對蛋白表達量無影響。
誘導(dǎo)劑IPTG是B一半乳糖苷酶底物的類似物，可與阻遏蛋白結(jié)合成復(fù)合物，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，不能與O基因結(jié)合，從而促進基因表達。因IPTG有潛在毒性，且價格昂貴，并不是表達蛋白的理想誘導(dǎo)物，目前因尚未找到合適替代品而沿用，但求用量減少。本實驗結(jié)果與相關(guān)研究一致，一定范圍內(nèi)，增大IPTG的濃度并不能增加蛋白表達量¨。0.25mmol/L是不影響蛋白表達量的最低濃度。
本研究證實，誘導(dǎo)時的菌種濃度是決定蛋白表達量的主要因素。當(dāng)OD為0.772時，誘導(dǎo)比較合適，細菌處于對數(shù)生長期，利于可溶性表達，且表達出的目的蛋白占菌體總蛋白的比例最高，約占41.5%。最終確定，當(dāng)菌種生長至OD。。約為0.7時，以0.25mmol/LIPTG在37℃誘導(dǎo)1h為最佳表達條件，為丁肝抗原的大量表達奠定了實驗基礎(chǔ)。
