發布時間：2020-04-08所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： [摘要]目的：觀察旋毛蟲(spiralis)感染對小鼠結腸上皮通透性的影響及其作用機制。方法：spiralis感染BALB/c小鼠。7d后直腸灌注辣根過氧化物酶(HRP)，在其后的0min、60min、120min，分別檢測小鼠血液中HRP的情況，尾靜脈采血檢測ISG和IsG，隨后處死小鼠，以EL
[摘要]目的：觀察旋毛蟲(spiralis)感染對小鼠結腸上皮通透性的影響及其作用機制。方法：spiralis感染BALB/c小鼠。7d后直腸灌注辣根過氧化物酶(HRP)，在其后的0min、60min、120min，分別檢測小鼠血液中HRP的情況，尾靜脈采血檢測ISG和IsG，隨后處死小鼠，以ELISA法和流式細胞術檢測腸系膜淋巴結中白細胞介素4(IL一4)的表達。另外，以spiralis感染STAT6敲除小鼠，同前法一樣操作，觀察相同指標。結果：spiralis感染組結腸通透性明顯增加，IL一4和IsGl明顯增高，IsG2。明顯降低(均P<0.05)。STAT6敲除小鼠實驗，spira一感染并未導致結腸通透性的增加(P>0.05);與BALB/c感染組小鼠相比，STAT6敲除感染組小鼠IL一4明顯較低(P<0.05)。結論：spiralis感染能夠導致小鼠結腸上皮通透性的增加，其作用機制可能是通過誘導IL一4的分泌來實現的。
[關鍵詞]旋毛蟲;結腸上皮;白細胞介素
有研究報道，巴西鉤蟲(Nippostrongylusbrasilien—s)感染導致腸道E—cadherin的表達改變，導致小腸上皮細胞的附著力損失;而多形螺旋線蟲(一ligmosomoidespolygyrus)感染導致小腸上皮通透性增加_2J。但腸道蠕蟲感染及其誘導的Th2反應對結腸上皮通透性影響的相關研究較少見。目前還不清楚蠕蟲感染是否可引起結腸上皮通透性改變和如何影響結腸上皮通透性。本文旨在觀察旋毛蟲對腸道黏膜通透性影響，并初步探討其機制。
材料和方法
1動物及分組
選擇6到8周大的雌性BALB/c小鼠(SPF級)，以高壓蒸汽消毒的食物和水喂養。將BALB/c鼠隨機分為2組，即spiralu感染組(BALB/c+T.S組)和無spiral~感染組(對照組，BALB/c組)。每只小鼠經口服喂養spiralis幼蟲400條(幼蟲配成懸液喂養，并以顯微鏡鑒定為活蟲)。
2結腸通透性的分析
小鼠感染spiralis7d后，直腸內給予辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP;Sigma)，然后測量血液中HRP濃度判定結腸通透性。在小鼠禁食12h之后，以2%戊巴比妥鈉麻醉(50mg/kg)，50辣根過氧化物酶(含0.6mg)以針頭經直腸注人。辣根過氧化物酶灌注后的0(即為未灌注HRP的時點)、6o和120min后，從尾靜脈收集血液樣本，采用EUSA法測定血清辣根過氧化物酶濃度。
3血清IgGl和IgG2。的檢測
將上述尾靜脈收集的血液樣本，以ELISA法檢測IgG1和IgG2的表達量。
4淋巴細胞細胞因子ELISA檢測
spiralis感染7d后，處死小鼠。所有小鼠經斷頸法處死。打開腹腔，取出腸系膜淋巴結(mesentericlymphnode，MLN)。將外周淋巴結分組研磨(溶液為cDMEM)，用70m的濾器過濾，4oC、1500r/min離心8min，棄除上清，加入2mLcDMEM溶液，將細胞振蕩溶解，將之調成5×10/L。加CD3單克隆抗體孵育，置于CO培養箱內，5%C0、37℃靜置培養72h，收集培養液上清，置于一20℃凍存。以ELISA法檢測Th2細胞因子白細胞介素4(interleukin一4，IL一4)的表達量。
5信號轉導子與轉錄激活子6(signaltransducerandactivatoroftranscription6。STAT6)基因敲除小鼠實驗
選6—8周雌性基因敲除小鼠(SPF級，BALB/c背景，購于美國杰克森實驗室)。將小鼠分為3組，STAT6敲除小鼠組(無spiralis感染，STAT6組)、BALB/c小鼠感染組(BALB/c+T.S組)和STAT6敲除小鼠感染組(STAT6+T.S組)，spiralis感染小鼠7d后，先行尾靜脈取血1次(在實驗結果中標示為0min)，然后以HRP經直腸注人，辣根過氧化物酶灌注后60和120min'~，從尾靜脈收集血液樣本，采用ELISA法測定血清辣根過氧化物酶濃度，以此來判定結腸上皮通透性。處死小鼠，取出腸系膜淋巴結，制作淋巴細胞懸液，加CD3單克隆抗體孵育72h。收集上清，ELISA法檢測細胞因子的變化。
6統計學處理
數據用均數±標準差(露±s)表示，采用Graph—PadPrism統計學軟件處理，進行t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。
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結果
1spiralis感染導致結腸上皮通透性變化
對照組小鼠血清的辣根過氧化物酶量很少。蠕蟲感染的小鼠血清辣根過氧化物酶水平顯著增高(HRP處理60min后)。結果表明腸道寄生蟲感染后結腸上皮通透性顯著增加，見圖1。
2血清IgG。和IgG2。的檢測結果
與無感染組比較，T.S感染組IgG。表達明顯增高，IgG：表達明顯降低，見圖2。
3腸系膜淋巴結細胞因子ELISA檢測結果
加CD3單克隆抗體刺激，無感染組IL一4(21.0±2.3)g/L，感染組IL一4(193.0±12.5)g/L，感染組IL一4的表達明顯增高，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。
4STAT6敲除小鼠蠕蟲感染不能改變結腸上皮通透性
BALB/c小鼠感染后血清辣根過氧化物酶水平顯著增加，有蠕蟲感染和無感染的STAT6敲除小鼠血清辣根過氧化物酶量無顯著差異，見圖4。
5STAT6敲除小鼠腸系膜淋巴結幾一4的變化
加CD3單克隆抗體刺激，BALB/c+T.S組IL一4(193.0±12.5)g/L，STAT6+T.S組IL一4(15.0.4-3.1)g/L，STAT6組IL一4(3.0±1.2)g/L，BALB/c+T.S組與STAT6+T.s組IL一4表達量比較，BALB/c+T.S組表達明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。
討論
我們的結果表明，在野生型BALB/C小鼠中，小腸spiralis感染能夠導致結腸上皮通透性增加，但在Th2缺陷的STAT6一小鼠中沒有出現這種情況。這些結果表明，機制之一可能是旋毛蟲感染影響了STAT6信號通路，從而改變結腸上皮屏障功能。
大分子HRP標記探針技術已廣泛用于測量腸上皮細胞運輸能力。通常情況下，腸腔可溶性抗原通過以下2條路線進行轉運：經細胞途徑或通過細胞間途徑。經細胞的通透性對大分子通過上皮細胞的轉運是一個重要的途徑，有助于調節免疫激活。有研究顯示，腸道蠕蟲感染增加了腸道細菌易位和細菌脂多糖吸收加人門靜脈循環，從而改變屏障功能,IL一4通過改變細胞間黏附分子明顯增強了高分子通透性。
spiralis主要寄生在腸道小腸，而我們觀察的是結腸上皮屏障功能的影響。因此，結腸上皮屏障功能改變與旋毛蟲直接導致的機械性損傷無關。在本研究中，我們用Th2缺陷STAT6敲除小鼠測試小腸蠕蟲是否通過蠕蟲引起的自適應免疫激活間接影響結腸上皮屏障功能。我們結果表明，在BALB/c鼠中，旋毛蟲感染導致了小鼠結腸上皮通透性增加，但是在Th2缺陷STAT6敲除小鼠中，印感染卻沒有出現這種情況，小鼠結腸通透性并沒有因spiralis感染而增加。這些結果充分表明淋巴細胞活化、尤其是Th2細胞的活化，在腸道蠕蟲感染中改變了腸道屏障作用。
Th2細胞因子IL一4和IL一13能夠通過STAT6或磷酸肌醇3一激酶(PDK)途徑影響它們靶細胞的激活。此前，Ceponis等使用T84細胞(人類結腸上皮細胞模型)研究IL一4和IL一13參與調節上皮通透性信號轉導通路，認為PDK是IL一4和IL一13調節跨上皮電阻(TER)的主要近端信號途徑。但是，最近的研究表明，Th2(IL—l3)依賴的屏障調控并不需要PI3K參與，但可能涉及STAT6，IL一13作為STAT6的抑制劑，不能抑制PDK，但能避免IL一13誘導的TER損失。我們研究顯示，spiralis感染在STAT6敲除小鼠中未能改變結腸上皮通透性，這個結果支持了蠕蟲感染時STAT6在調節過程中的腸上皮屏障功能的作用。這些結果進一步提示STArI’6信號通路和Th2免疫反應在調節腸道黏膜屏障中的作用。
總之，我們的研究表明，蠕蟲感染能導致結腸上皮完整性和腸道上皮屏障功能的改變，而在其中一個潛在的機制可能是蠕蟲感染誘導的腸道黏膜上淋巴細胞誘導產生的Th2反應參與造成的。以前研究均提示-8。。，蠕蟲感染中腸道黏膜免疫反應的調節涉及多種作用機制，包括先天性和適應性免疫系統效應細胞的調節。對蠕蟲免疫調節作用機制更深一步的了解，不僅將為免疫介導的疾病建立新穎和更有效的治療方法，而且還能為慢性腸道蠕蟲感染嚴重地區的微生物疾病預防和治療設計有效腸道疫苗。
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