發布時間：2020-04-08所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：目的觀察姜黃素對氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導的大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的影響，并探討血紅素氧合酶一1(HO一1)在姜黃素抑制血管平滑肌細胞增殖中的作用及機制。方法體外分離培養大鼠血管平滑肌細胞并行免疫組化鑒定，以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法
摘要：目的觀察姜黃素對氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導的大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的影響，并探討血紅素氧合酶一1(HO一1)在姜黃素抑制血管平滑肌細胞增殖中的作用及機制。方法體外分離培養大鼠血管平滑肌細胞并行免疫組化鑒定，以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細胞增殖率、逆轉錄一聚合酶鏈式反應(RTPCR)檢測HO一1mRNA水平，蛋白免疫印跡法(Westernblot)分別檢測HO-1及增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達水平。結果0IDL呈濃度依賴性(0～150“g/mL)地誘導VSMC增殖，達到200/~g/mL具有細胞毒性;姜黃素呈濃度依賴性(40、80~mol/L)地抑制Ox-LDL(100“g/mL)所誘導的VSMC增殖，HO-1抑制劑鋅原卟啉IX(ZnPPIX)可明顯減弱此抑制效應;姜黃素可誘導VSMC上調HO-1mRNA和蛋白表達;姜黃素可減弱Ox-LDL誘導VsMcs增殖細胞核抗原的高表達，此效應可被H0—1抑制劑ZnPPIX抑制。結論姜黃素通過降低HO-1介導的PCNA表達，進而抑制0LDL誘導大鼠血管平滑肌增殖。
關鍵詞：姜黃素;氧合酶類;脂蛋白類，LDL
動脈樣硬化(atherosclerosis，AS)的發生機制十/寸復雜，q前研究表明氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipo—protein，Ox-LDL)及血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecell，VsMc)增殖是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要病理基礎¨1J。姜黃素是從姜黃、郁金、莪術等植物中提取的一種生物多酚化合物，研究顯示姜黃素具有抗炎、抗氧化、促細胞凋亡和抑制細胞增殖等藥理作用，這些作用可有效拮抗AS的發生與發展。血紅素氧合酶一l(hemeoxygenase一1，HO-1)是血紅素降解的起始酶和限速酶，發揮著抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡和改善組織微循環作用，動物研究已經證明過表達HO-1可以明顯延緩As進展|2]，但是姜黃素抗AS的相關機制還不甚清楚。本研究旨在于細胞水平探討姜黃素對Ox-LDL誘導血管平滑肌細胞增殖的影響及其相關機制，為其藥理作用提供理論基礎。
1材料與方法
1.1材料DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibico公司;姜黃素、鋅原卟啉IX(zineprotoporphyrinⅨ，zn—PPIX)購自Sigma公司;Ox-LDL購于北京普博斯生物科技有限公司;反轉錄一聚合酶鏈反應(RT—PCR)試劑均購自美國1n一vitrogen公司;一抗、二抗均購于美國SantaCruz公司;SD大鼠購自南方醫科大學實驗動物中心;其余實驗相關產品購自碧云天生物技術公司。
1.2方法
1.2.1細胞培養與實驗分組按常規組織貼塊方法_3原代培養并傳代，取用第3～8代細胞。免疫組化法鑒定血管平滑肌細胞。血管平滑肌細胞用含1O%胎牛血清的DMEM培養基于37℃、5C02下培養。實驗分組：(1)正常對照組：不加任何處理;(2)不同終濃度Ox-LDL刺激組(0、50、100、150、200、250/~g/mL);(3)不同終濃度姜黃素組(O、2o、4O、80ttmol/L);(4)不同終濃度姜黃素組(0、20、40、80/~mol/L)+Ox-LDL(100/~g/mL)組;(5)Ox-LDL(100/,g/mL)+姜黃素組;(6)姜黃素+ZnPPlX+Ox-IDL(100“g/mI)組。
1.2.2反轉錄聚合酶鏈反應檢測H0—1mRNA按Trizol試劑盒說明提取總RNA。取細胞RNA1“L根據試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，進行PCR擴增。HO-1：上游5GGGT—GACAGAAGAGGCTAAGACC3，下游5AGATTCTC—CCCTGCAGAGAGAAG3。擴增條件：94℃變性30s，56℃退火30S，72℃延伸45S，循環3o次。電泳條帶采用凝膠成像系統分析。
1.2.3四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法比色測定VSMC增殖率VSMC接種96孔培養板中(每孔1×10個細胞)孵育24h，換無血清DMEM培養基24h后棄培養液，按實驗分組加入藥物。2Oh后加入5mg/mIMTT1OL，孵育4h，終止反應。棄孔內培養液上清液加二甲基亞砜100”L，選擇492nm自動酶標光度計測定各孔吸光度值。細胞增殖率計算公式：細胞增殖率(cellviability)一處理孔AⅢ/x~照孑LA492×100。
1.2.4蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測HO-1及增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)蛋白表達水平收集細胞并加入細胞裂解液裂解細胞，離心收集上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)法測蛋白濃度。蛋白(30“g)經12十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectroDheresis，SDPAGE)分離后轉移至聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidenedifluo—ride，PVDF)膜。5牛血清清蛋白室溫封閉4h，加入一抗4℃過夜、二抗室溫孵育2h，最后顯像。1.3統計學處理數據均采用i±S表示，采用單因素方差分析，總體有差異兩兩比較采用最小顯著差數法。采用SPSS13.0軟件進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1大鼠血管平滑肌細胞鑒定培養的第3代細胞經免疫細胞化學檢測，特異性的a—actin在免疫細胞化學染色后，胞漿著色，呈陽性反應，在鏡下可見胞漿內大量棕色、與細胞長軸平行的纖維細絲，即平滑肌肌動蛋白，見封3圖1。
2.2Ox-LDL對誘導大鼠血管平滑肌細胞(VsMC)增殖的影響Ox-LDL呈濃度依賴性(0～150/,g/mL)地誘導VSMC增殖，但是當達到200>g/mi刺激組時，細胞數目減少，提示到達此濃度可能具備細胞毒性。各個濃度刺激組與空白對照組相比，細胞增殖顯著，差異具有統計學意義
2.3姜黃素對Ox-IDL刺激的VSMCs增殖的影響不同終濃度的姜黃素(40、80/lmol/I)可明顯抑制Ox—LDL(100g/mL)誘導的細胞增殖效應，且呈濃度依賴性;姜黃素(40、80“mot/L)+Ox-IDL組與Ox-LDI單獨作用組相比，細胞增殖率顯著降低，差異具有統計學意義(P
2.4HO一1抑制劑ZnPPIX對姜黃素抑制Ox-IDL所誘導的VSMC增殖的影響給予HO1抑制劑ZnPPⅨ預處理細胞后，姜黃素抑制OxLDI所誘導的VSMCs增殖效應減弱;姜黃素+ZnPPIX+Ox-IDI組與姜黃素+Ox-LDI組相比，細胞增殖率增加明顯(P<0.05)，見圖4。
2.5姜黃素對VSMC的HO一1表達的影響不同濃度姜黃素組干預VSMC的H(YlruRNA和蛋白表達水平明顯高于空白對照組，實驗重復3次，見封4圖5。2.6姜黃素對Ox-LDL刺激VSMC的PCNA表達的影響相比較于空白對照組，O~LDL可明顯增強PCNA的表達;而姜黃素+Ox-LDI組與Ox-IDL組單獨作用比較，可明顯抑制PCNA的表達;在加入HO1抑制劑ZnPPⅨ后，姜黃素+OxLDL組的抑制PCNA表達效應可被減弱，實驗重復3次，見封4圖6。
3討論
平滑肌細胞增殖是AS斑塊形成過程中的重要環節，大量研究表明動脈血管壁增厚至斑塊形成是AS病變的主要病理特征。Ox-LDL促進AS形成的作用已被大量的研究所證實。目前認為AS形成初期步驟是LDI進入內皮損傷部位的血管壁，氧化、誘導多種趨化因子，并激活單核細胞分泌不同的生長因子和細胞因子，刺激平滑肌細胞遷移、增殖。因此，Ox—IDL在AS中起到關鍵作用。
HO—l是血紅素降解的起始酶和限速酶，HOl通過降解血紅素產生一氧化碳(carbonmonoxide，CO)、膽綠素和鐵離子。膽綠素進一步經膽綠素還原酶作用生成膽紅素，而鐵離子能誘導鐵蛋白的合成_4]。HO一1的這些終產物具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗血栓的作用;另外，CO和膽色素通過影響血管平滑肌細胞、內皮細胞、內皮祖細胞和粒細胞的增殖、遷移和黏附保護受損動脈血管內平衡E53。姜黃素是中藥姜黃的主要成分，其抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血栓以及心血管的保護作用已經被證實l6]。目前已經有研究表明姜黃素具有抗細胞增殖的作用，但是具體機制還不甚清楚_8_。根據其眾多藥理作用與HO一1保護作用相似，姜黃素的相關保護作用是否經過HO-1介導值得研究。
本研究結果顯示，Ox-LDL在一定濃度范圍內濃度依賴性地誘導血管平滑肌細胞增殖，當超過一定濃度，具備細胞毒性。此實驗發現與Chang等l9的研究結果相類似，說明了OX-LDL對血管平滑肌細胞增殖影響的特點，其機制可能是通過激活Ras/Raf/MEK/MAPK通路促進細胞有絲分裂[1。與之類似，Schwer等[1l_也發現姜黃素HO-1介導抑制胰腺星狀細胞的增殖由阻遏ERK1/2磷酸化的機制實現。同時，本組也發現姜黃素可有效抑制Ox-LDL誘導血管平滑肌細胞增殖，并且此抑制效應可被HO-1的抑制劑ZnPPⅨ部分阻斷。這提示HO—l很可能參與了姜黃素抑制Ox-LDL誘導血管平滑肌細胞增殖的保護效應。同樣，有學者發現在球囊損傷的大鼠模型中，H0—1介導N0抑制大鼠血管平滑肌增殖，從而顯著地抑制了內膜增生¨1。為了進一步證實此發現，本組觀察了姜黃素對血管平滑肌細胞H0—1mRNA和蛋白表達的影響，發現姜黃素可顯著地上調血管平滑肌細胞HO一1mRNA和蛋白表達。綜上所得出的實驗結果，提示姜黃素抗Ox-LDL誘導血管平滑肌細胞增殖的作用經過HO-1介導。
PCNA又稱周期蛋白，是一種與細胞增殖周期有關的核內糖蛋白，是DNA復制的必需成分，其表達與細胞增殖活性有關，是使細胞由靜息期進入s期的關鍵蛋白D33，已成為評價細胞增殖狀態的一項客觀指標。本組研究發現HO一1抑制劑上調姜黃素抑制Ox-LDL誘導VSMCs增殖細胞核抗原高表達，提示HO-1介導的抑制增殖的效應可能部分通過抑制PCNA表達實現。另外研究發現HO-1的抗增殖效應通過上調細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子P21_1，P21是細胞周期素蛋白cdk一2抑制蛋白，cdk_2亦是細胞周期G和s期調節關鍵。Liu等[15]以含HO一1基因的重組腺病毒轉染大鼠主動脈平滑肌細胞，被轉染的大鼠主動脈平滑肌細胞以劑量依賴方式表達HO一1mRNA、HO-1蛋白和提高酶的活性，刺激促凋亡基因p53表達，促進VSMCs凋亡而抑制血清刺激的VSMCs增殖。
綜上所述，姜黃素顯著地抑制Ox-LDL誘導的大鼠VSMC增殖，其機制是由H(9-1介導的PCNA表達下調實現的。這為進一步研究姜黃素防治AS提供了一定的理論依掂。
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