發(fā)布時間：2020-04-11所屬分類：醫(yī)學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要目的：研究大蒜素對胃癌細胞SGC.7901生長的抑制及其機制。方法：應(yīng)用MTr、RTPCR及Westernblot等方法觀察細胞形態(tài)、P38及Caspase一3蛋白及基因的表達情況。結(jié)果：(1)大蒜素抑制細胞生長、凋亡細胞增多(P0.05)。(2)大蒜素作用下胃癌細胞p-P38、Caspase一3
摘要目的：研究大蒜素對胃癌細胞SGC.7901生長的抑制及其機制。方法：應(yīng)用MTr、RT—PCR及Westernblot等方法觀察細胞形態(tài)、P38及Caspase一3蛋白及基因的表達情況。結(jié)果：(1)大蒜素抑制細胞生長、凋亡細胞增多(P<0.05)。(2)大蒜素作用下胃癌細胞p-P38、Caspase一3表達量增加(P<0.05)。結(jié)論：大蒜素能抑制胃癌細胞增殖.誘導(dǎo)凋亡。
關(guān)鍵詞胃腫瘤;大蒜素;凋亡
胃癌在全球發(fā)病率高，死亡率在惡性腫瘤中居第二。五年生存率仍僅為7%～14%，因此尋找新的治療靶點對于胃癌的防治具有重要的意義…。實驗發(fā)現(xiàn)大蒜素通過直接殺傷腫瘤細胞及調(diào)節(jié)機體免疫功能兩個方面干擾腫瘤細胞生長進而抑制腫瘤的發(fā)生[。本實驗通過觀察大蒜素對胃癌細胞株SGC一7901生長及凋亡的影響，探討對胃癌生長抑制及促進其凋亡的可能作用機制。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1細胞株及實驗材料胃癌SGC.7901細胞株(中國科學院上海生命科學研究院);大蒜素(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司);RPMI.1640(美國Gibco公司);Hoechst染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Trizol試劑盒(美國Gibco公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司);兔抗人P—p38抗體(CellSignaling公司);兔抗人Caspase.3抗體(abeam公司);二抗(美國Bioworld公司)。
1.1.2引物根據(jù)Genebank資料庫.應(yīng)用premiers5.0軟件設(shè)計和確定最優(yōu)引物。然后經(jīng)Blast匹對，由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng)人胃癌細胞SGC.7901在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng).用0.25%胰蛋白酶消化傳代，37℃、5%CO：、95%濕度條件下的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。
1.2.2實驗分組將細胞分為3組：(1)空白組;(2)對照組：含培養(yǎng)細胞，不加藥物干預(yù);(3)大蒜素作用組：含培養(yǎng)細胞，藥物作用終濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0~zg/mL亞組。以上每組均設(shè)4個平行孑L。
1.2.3MTT法測定細胞生長抑制率收集對數(shù)生長期的細胞.以10eells/~L的密度鋪于96孔板，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度，繼續(xù)培養(yǎng)48h，棄去培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)液100L/孔，MTT20~L/：fL，培養(yǎng)4h后加人二甲基亞砜150L/孔，振蕩10min，490nm波長測定吸收值。抑制率=(A對照組一A藥物組)/a對照組×100%。繪制抑制曲線，計算藥物半數(shù)抑制率(IC50)。
1.2.4Western.Blot檢測蛋白，表達、RT.PCR檢測基因表達細胞鋪24孔板24h后，按設(shè)定濃度加入大蒜素，每一濃度組4孔。培養(yǎng)72h后移去上清，直接裂解、收集細胞。提取總蛋白，Westernblotting法檢測p.P38MAPK、Caspase.3蛋白水平。以Tubulin作為內(nèi)參AlphaEaseFC4.0圖像分析軟件進行分析。提取總RNA，RT—PCR檢測P38MAPK、Caspase-3mRNA的表達水平。
1-3統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料用±S表示。兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。組間比較采用單因素方差分析。P<0.O5認為差異有統(tǒng)計學意義。
2結(jié)果
2.1大蒜素抑制胃癌細胞SGC.7901增殖MTT檢測顯示大蒜素能夠顯著抑制細胞增殖，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。2.5～40.0~g/mL不同濃度大蒜素作用SGC.7901細胞株24h，對SGC.7901細胞的增殖抑制率從2.43%升高到67.38%。與對照組相比.除2.5~g/mL組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。作用48h，對細胞的增殖抑制率從4.42%升高到79.9l%。與對照組相比。各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。作用72h，細胞的增殖抑制率從7.23%升高到91.35%。與對照組相比，各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而低濃度2.5p~g/mL大蒜素作用SGC一7901細胞株24、48、72h的抑制率從2.43%遞增到7.23%：高濃度40.0~g/mL大蒜素作用SGC.7901細胞株24、48、72h的抑制率從67.38%遞增到91.35%(表1)。
2.2細胞形態(tài)學觀察光鏡觀察：對照組腫瘤細胞密度高，布滿整個觀察視野，細胞增殖旺盛，部分細胞因生長擁擠漂浮，細胞貼壁性好，胞漿豐富且分布均勻，胞核大、深染，核周有凹陷性切跡，核分裂像多見;隨著藥物作用濃度的提高(2.5～10.0p~g/mL)，細胞數(shù)量逐漸減少，貼壁性減弱，細胞質(zhì)中顆粒增多，細胞透亮度降低，細胞之間間隙加大.細胞膜邊緣毛糙;20.0、40.0~g/mL大蒜素作用72h后，細胞數(shù)量明顯減少，密度減低，貼壁性差，大部分細胞漂浮、死亡，細胞形態(tài)變得不規(guī)則，細胞之間間隙加大，細胞質(zhì)中空泡增多明顯，細胞膜邊緣毛糙明顯，核漿比例下降，核分裂像少見。
2.3RT.PCR檢測P38及Caspase.3mRNA表達情況不同濃度大蒜素作用于胃癌SGC一7901細胞72h后.以Trizol法提取細胞總RNA，進行RTPCR半定量檢測，結(jié)果如圖1，并對其進行半定量分析，基因半定量分析顯示：2.5—4O.0~xg/mL不同濃度大蒜素作用SGC.7901細胞株72h后，其Caspase一3/GAPDH值從0.223升高到1.131，與對照組相比，差異具有顯著性，不同濃度之間亦有顯著性差異(P<0.01);P38/GAPDH值從0.252升高到0.881，與對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)。
可發(fā)現(xiàn)不同濃度大蒜素作用SGC一7901細胞株72h后。P38/GAPDH與Caspase一3/GAPDH比值均隨著濃度增高而逐漸升高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義。由此可見：大蒜素作用于胃癌SGC一7901細胞可顯著增強細胞中P38及Caspase.3mRNA的表達.并且隨著藥物濃度的增加而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。
2.4WseternBlot檢測p-P38及Caspase.3蛋白表達情況大蒜素以不同的濃度作用于胃癌SGC7901細胞72h后.對細胞進行Westernblot的檢測.結(jié)果如圖2所示用ImageJ軟件對WesternBlot結(jié)果進行分析，并將所得數(shù)據(jù)通過SPSS16.0進行統(tǒng)計學分析.單因素方差分析結(jié)果顯示，不同濃度大蒜素誘導(dǎo)下P—P38及Caspase一3蛋白表達量的相對值(與Tubulin的比值)隨著大蒜素濃度的升高而升高(P<0.05)，與基因表達情況相似均呈現(xiàn)濃度依賴性
3討論
經(jīng)典的細胞凋亡信號傳導(dǎo)通路有以下3條]：(1)死亡受體通路，以Fas/FasL通路為代表。(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。(3)線粒體通路，引起下游Caspase級聯(lián)反應(yīng)。以上3條通路最后均通過Caspase共同通路介導(dǎo)細胞凋亡。而Caspase一3作為Caspase家族成員功能相對較明確的凋亡效應(yīng)分子，在細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。P38MAPK信號傳導(dǎo)通路是MAPK通路的分支之一，其在炎癥、應(yīng)激、凋亡、細胞周期和生長的多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用l7_，而且可能是潛在的腫瘤治療的靶目標有研究表明P38MAPK激活會導(dǎo)致Caspase一3表達增加從而促進凋亡[1o]。本實驗通過觀察不同濃度大蒜素對胃癌細胞生長及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)P38、Caspase.3mRNA及蛋白表達均隨著大蒜素濃度增加而增加，大蒜素能夠誘發(fā)胃癌細胞凋亡，隨著作用濃度的增加或作用時間的延長.胃癌細胞凋亡增多。由此我們推斷，大蒜素通過增加P38基因的表達，進而激活P38MAPK途徑的信號表達，進而增加Caspase.3的表達，從而引起Caspase.3級聯(lián)反應(yīng)，抑制細胞生長，促進細胞凋亡。然而，究竟大蒜素是通過P38表達的增加調(diào)節(jié)Caspase.3表達的變化。亦或是直接調(diào)節(jié)P38及Caspase.3表達我們尚無法界定，因此在下一步實驗中我們會對P38進行阻斷，從而明確兩者之間的聯(lián)系。
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綜上所述，本實驗的研究結(jié)果表明，大蒜素能夠抑制胃癌細胞SGC.7901的增殖，誘發(fā)凋亡，其機制與Caspase.3的表達增加相關(guān)。由此提示P38MAPK/Caspase.3途徑在調(diào)控胃癌細胞凋亡方面的作用，從而為抗腫瘤治療提供一個新的思路。但是大蒜素激活P38，進而激活Caspase途徑的具體方式尚未深人探討，還需進一步的研究
